稻瘟病抗性基因Pita特异性分子标记的开发及应用

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记辅助选择王忠华;贾育林;吴殿星;夏英武【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2004(30)12【摘要】利用已建立的水稻抗稻瘟病基因Pi-ta显性分子标记对30个品系和157个来自不同国家的一些水稻品种进行分子鉴定,并采用稻瘟病菌菌株ZN57(IC-17)和ZN61(IB-49)人工接种试验进行致病性测试.结果表明,大部分品系和少数水稻品种含抗病基因Pi-ta,且对稻瘟病菌菌株ZN57和ZN61表现抗病反应.除此之外,利用两对显性分子标记YL155/YL87和YL183/YL87对350个杂交F3代株系进行早期筛选,得到118个抗病基因Pi-ta纯合的株系.这些株系田间抗性调查结果表明,抗病基因存在与否与田间抗性相吻合.因Pi-ta基因与许多其他抗病基因紧密连锁,而使含有Pi-ta基因的品种具有广谱抗性,由此确立了Pi-ta基因显性分子标记在育种辅助选择中的应用价值.【总页数】7页(P1259-1265)【作者】王忠华;贾育林;吴殿星;夏英武【作者单位】浙江万里学院生物技术研究所,浙江宁波,315100;USDA-ARS Dale Bumpers National Rice Research Center Stuttgart Arkansas USA,72160;浙江大学原子核农业科学研究所,浙江杭州,310029;USDA-ARS Dale Bumpers National Rice Research Center Stuttgart Arkansas USA,72160;浙江大学原子核农业科学研究所,浙江杭州,310029;浙江大学原子核农业科学研究所,浙江杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.黑龙江省水稻种质资源抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记检测 [J], 黄晓群;郭震华;王瑞英;张兰民;王翠;周雪松;赵海新2.水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立 [J], 王忠华;Redus MARC;贾育林3.利用分子标记辅助选择聚合水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因 [J], 姚姝;陈涛;张亚东;朱镇;赵庆勇;周丽慧;赵凌;赵春芳;王才林4.利用分子标记辅助选择聚合水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b和Stv-bi [J], 王军;杨杰;陈志德;范方军;朱金燕;杨金欢;仲维功5.利用分子标记辅助选择聚合水稻Pi-ta,Pi-b和Pi-9基因 [J], 刘凯;唐红生;孙明法;宛柏杰;赵绍路;朱静雯;张桂云;代金英;严国红;王爱民;朱国永因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专利名称：一种水稻稻瘟病抗性基因Pita的dCAPS分子标记及应用
专利类型：发明专利
发明人：杨德卫,何旎清,黄凤凰,余敏祥
申请号：CN202210204999.6
申请日：20220302
公开号：CN114480715A
公开日：
20220513
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开水稻稻瘟病抗性基因Pita的dCAPS分子标记机应用，稻瘟病抗性基因Pita功能特异性分子标记为Pita‑dCAPS；所述Pita‑dCAPS分子标记利用引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2从携带有稻瘟病抗性基因Pita的水稻品种的基因组DNA中扩增出来，并且可以被内切酶Ecop151特异性识别，而不含有抗性基因Pita水稻品种的基因组DNA不能被内切酶Ecop151识别；其
中，SEQIDNO.1：5’‑ATCACGGGTATGGATTTTTCA‑3’；SEQIDNO.2：
5’‑GTGCATCTTCAACCTGACTTGATGATTGTTTGA‑3’；本发明获得的稻瘟病抗性基因Pita的dCAPS分子标记能够应用于鉴别水稻品种中稻瘟病抗性基因Pita。

申请人：福建省农业科学院水稻研究所
地址：350019 福建省福州市仓山区城门乡连坂村
国籍：CN
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稻瘟病抗性基因Pi2、Pita的特异KASP标记开发与应用陈静;饶刚顺;刘婉卿;李惠芬;杨义强;徐鹏;王重荣【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2024(51)5【摘要】【目的】水稻稻瘟病抗性基因Pi2和Pita是对华南稻区稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因,对水稻的稻瘟病抗性育种具有重要应用价值,开发一套高效的鉴定方法有利于提高水稻抗病品种培育效率。

【方法】根据高抗稻瘟病品种‘黄广油占’与高感稻瘟病品种‘广陆矮4号’在Pi2基因的第787位、第788位密码子上的变异GCA GGA/GTG TTA,以及高抗稻瘟病国际稻种质资源Tetep与高感稻瘟病地方种质资源丽江新团黑谷在Pita基因第6 640位碱基上的变异G/T,基于竞争性等位基因PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)标记技术原理,开发抗稻瘟病基因的分子标记。

【结果】开发了两个抗稻瘟病基因Pi2和Pita的功能位点KASP标记(W-Pi2、W-Pita),利用标记对广东省农业科学院水稻研究所培育的常规稻、香稻、杂交稻新品种进行检测,筛选出抗性品种19个,其中单个基因检测为抗病等位基因型的水稻品种有13个,两个基因均为抗病等位基因型的品种有6个,比较两个标记结果,Pi2抗性等位基因在育成品种中的频率高于Pita抗性等位基因频率。

综合所有结果,表明2个标记可在早期(种子或苗期)检测育种材料抗稻瘟病基因Pi2和Pita的等位基因型,无需将育种材料种植到病圃鉴定即可筛选出抗病单株。

【结论】利用开发的KASP功能分子标记W-Pi2、W-Pita能够较好区分不同抗性的水稻亲本品种,可清楚区分水稻育种材料间不同的等位基因型,对育种材料进行准确筛选。

【总页数】9页(P93-101)【作者】陈静;饶刚顺;刘婉卿;李惠芬;杨义强;徐鹏;王重荣【作者单位】广东海洋大学滨海农学院;广东省农业科学院水稻研究所/广东省水稻育种新技术重点实验室/广东省水稻工程实验室【正文语种】中文【中图分类】S330【相关文献】1.稻瘟病抗性基因Pita特异性分子标记的开发及应用2.抗稻瘟病 Pi2/9/z-t 基因特异性分子标记的开发3.基于KASP技术的稻瘟病抗性基因Pi9分子标记的开发与评价4.分子标记辅助聚合基因Pi1和Pi2改良红色特种籼稻稻瘟病抗性研究5.水稻抗稻瘟病基因Pi2的KASP标记开发与应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

稻瘟病新抗性基因Pita2候选基因的表达载体构建摘要:为了验证稻瘟病新抗性基因Pita2的功能,利用长片段PCR技术从基因的供体品种PiNo.4中扩增了2个候选基因Pita2-1,Pita2-2,长度分别为6.1 kb和16.5 kb,电泳回收目的片段,然后利用双酶切分别克隆到植物表达载体pCAMBIA1300｡对阳性克隆通过菌落PCR､酶切鉴定和测序分析,已成功地获得了2个候选基因的重组阳性克隆,为进一步研究Pita2基因的功能奠定了基础｡关键词:稻瘟病;候选抗性基因;长片段PCR技术;表达载体Construction of Expression Vector for Candidate Genes of New Rice Blast Resistance Gene Pita2Abstract: Rice blast is one of the most devastating diseases of rice, and a serious threat to rice production. Exploring new rice blast resistance genes for breeding disease resistance strains is an important strategy. To study the function of two candidate genes Pita2-1 and Pita2-2, long-range PCR(LR-PCR) was employed to amplify the candidate genes from genomic DNA of the resistant cultivar PiNo.4. The appropriate products of Pita2-1(6.1 kb)and Pita2-2(16.5 kb) were purified and then ligated into the binary vector pCAMBIA1300 respectively. The positive clones were confirmed by colony PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing, thus laid a foundation for dissecting the function of gene Pita2.Key words: rice blast disease; candidate resistance gene; long-range PCR; expression vector稻瘟病是最具毁灭性的水稻病害之一,严重威胁着水稻的生产｡相对于化学防治法的高成本和高污染,培育和合理利用抗病品种,是控制这一病害最经济和环保的方式手段[1,2]｡由于稻瘟病菌生理小种的遗传复杂性及易变性,抗病品种常常推广种植几年后就丧失抗性[3,4]｡发掘和创造具有广谱抗性的新抗源和抗性基因,是抗稻瘟病育种的主要研究方向｡稻瘟病广谱新抗性基因Pita2被定位于水稻第12条染色体着丝粒区域一个大的基因簇内[5]｡而这一基因簇包含了14个已知的稻瘟病抗性基因,包括Pi20､Pita､Pita2､Pi4､Pi6､Pi12､Pi19､Pi21､Pi24､Pi31､Pi32､Pi157､Pitq-6和Pi39[6]｡尽管Pita已被克隆,并与相应的无毒基因间互作已在分子水平上得到了阐述[7],但由于着丝粒区域的高度重复序列和抑制重组的特性,导致这一区域的研究进展缓慢｡开展稻瘟病广谱抗性基因Pita2的克隆及功能研究,对加快着丝粒相关区段基因资源的开发和有效利用,以及新的抗性品种育成具有重要的应用价值,同时也对探讨抗性基因的起源及其进化的分子机理具有一定的参考价值｡1材料与方法水稻品种为携带Pita2的抗病品种PiNo.4,大肠杆菌菌株DH10B,双元载体pCAMBIA1300,均由中南民族大学生物技术国家民委重点实验室提供｡LA Taq DNA聚合酶长片段PCR扩增试剂盒(TaKaRa LA Taq DNA聚合酶,2×GC Buffer I,dNTP),T4 DNA连接酶,碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase｡CIAP),购自TaKaRa公司;AxyPrep质粒提取试剂盒､DNA凝胶回收试剂盒,以及PCR清洁试剂盒,购自爱思进生物技术(杭州)有限公司;PCR引物由金思瑞科技(南京)有限公司合成｡水稻基因组DNA利用CTAB法提取｡利用软件Primer Premier 5.0对Pita2的2个候选基因Pita2-1和Pita2-2设计特异性引物｡利用长片段PCR技术扩增目的片段,扩增片段包括基因的5′启动子和3′终止子区域,PCR程序采用两步法:94℃预变性2 min,然后进行30个循环:94℃,30 s;65℃,6.5 min;72℃,10 min,其中退火温度和延伸时间根据候选基因的大小和引物序列作相应的变化｡用AxyPrep胶回收试剂盒分别回收和纯化目的片段后,将2个候选基因利用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ分别克隆到pCAMBIA1300载体上｡然后对阳性克隆通过菌落PCR和酶切鉴定,并且测序验证｡2结果与分析2.1候选基因的扩增以Pita2候选基因的特异性引物对水稻品种PiNo.4的基因组DNA进行长片段PCR梯度扩增｡候选基因Pita2-1在退火温度为64.1℃和63.0℃时,都获得了1条6.1 kb的特异性好而强的单带(图1);Pita2-2在退火温度为62.8℃和62.0℃时,均获得了1条16.5 kb的特异性较好的单带(图2)｡2.2候选基因的表达载体构建对扩增的目的片段,分别回收､纯化,利用双酶切分别克隆到pCAMBIA1300载体,经蓝白斑筛选,菌落PCR和酶切鉴定(图3,图4),分别获得2个候选基因的阳性重组子｡对插入片段测序后,在GenBank中通过BLASTN进行核酸同源性搜索()｡结果表明,插入片段的序列着陆到水稻测序品种日本晴的第12条染色体上,该区域与目的基因的物理定位区域一致｡3讨论在完成图位克隆中的抗性基因精细定位后获得图位克隆是最关键的步骤,最关键步骤是获得目的基因的候选基因克隆,但在常规的图位克隆技术体系中,通常通过构建大片段基因组人工染色体文库,然后利用与目的基因共分离的分子标记来筛选文库而获得其候选基因的克隆,该过程由于必须对该候选基因进行亚克隆,而且亚克隆技术存在耗时､花费高的缺点[7,8],而且对筛选到的候选基因克隆必须亚克隆才能进行遗传转化｡而亚克隆技术存在切断目的基因甚至遗漏目的基因等缺点[7,8]｡通过长片段PCR技术可以快速､高效地直接从基因组DNA中扩增得到完整的目的基因[9,10],这将极大地缩短图位克隆的时间｡该研究中利用长片段PCR技术成功地获得了2个候选基因片段,并通过双酶切将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1300,下一步将通过农杆菌介导的遗传转化转入感病品种｡该研究为稻瘟病新抗性基因Pita2的功能验证奠定了一定的基础｡参考文献:[1] ZHANG Q F. Strategies for developing green super rice[J]. Proc Nati Acad Sci USA,2007,104:16402-16409.[2] V ALENT B, CHUMLEY F G. Molecular genetic analysis of the rice blast fungus, Magnaporthe grisea[J]. Annual Review of Phytopathology,1991,29:443-467.[3] YOSHIDA K,SAITOH H,FUJISAWA S,et al. Association genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae[J]. The Plant Cell,2009, 21:1573-1591.[4] HITTINGER C T,CARROLL S B. Gene duplication and the adaptive evolution of a classic genetic switch[J]. Nature,2007, 449:677-681.[5] RYBKA K,MIYAMOTO M,ANDO I,et al. High resolution mapping of the indica-derived rice blast resistance gene II. Pita2 and Pita and a consideration of their origin[J]. Mol. Plant-Microbe Interact,1997,10(4):517-524.[6] LIU X,YANG Q,LIN F,et al. Identification and fine mapping of Pi39(t), a major gene conferring the broad-spectrum resistance to Magnaporthe oryzae[J]. Mol Genet Genomics,2007, 278(4):403-410.[7] 黄骥,张红生,曹雅君,等.水稻功能基因的电子克隆策略[J]. 中国水稻科学,2003,16(4):295-298.[8] 吴乃虎. 基因工程原理[M]. 北京:科学出版社,2001.56-59.[9] SONG J Q,BRADEEN J M,NAESS S K,et al. Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight[J]. Proc Nati Acad Sci USA,2003,100(16):9128-9133.[10] LIU X Q,LIN F,WANG L,et al. The in silico map-based cloning of Pi36, a rice coiled-coil–nucleotide-binding site–leucine-rich repeat gene that confers race-specific resistance to the blast fungus[J]. Genetics,2007,176:2541-2549.。

专利名称：水稻稻瘟病抗性基因Pita的SNP分子标记的开发和应用
专利类型：发明专利
发明人：彭佩,郑秀婷,江南,梁毅,唐顺学,肖金华,田冰川
申请号：CN202011452971.1
申请日：20201211
公开号：CN112442547A
公开日：
20210305
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Pita的SNP分子标记的开发和应用。

所述SNP分子标记为K_120501，K_120501的多态性为G或C。

利用所述分子标记，可快速、精准的检测水稻稻瘟病抗性基因Pita。

本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，有利于Pita基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。

申请人：华智生物技术有限公司
地址：410000 湖南省长沙市芙蓉区合平路618号
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
代理人：肖云
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稻瘟病抗性基因Pita和Pib在我国水稻主栽品种中的分布时克;雷财林;程治军;许兴涛;王久林;万建民【期刊名称】《植物遗传资源学报》【年(卷),期】2009(10)1【摘要】主效抗稻瘟病基因Pita和Pib在我国很多稻区表现高水平的稻瘟病抗性,被广泛应用于我国的水稻育种和生产。

但这2个基因在国内主栽品种中的分布及利用情况一直缺乏详细的资料,致使育种利用上存在着盲目性。

本研究利用源于Pita和Pib基因本身的特异性分子标记,结合稻瘟病菌接种鉴定,检测和分析了我国58份水稻主栽品种(杂交稻亲本)的Pita和Pib抗性基因型。

结果表明,特籼占25、佳禾早占、密阳46、测64-7等4个籼稻品种携带Pita和Pib2个基因;籼小占等4个籼稻品种(系)和早丰9号等5个粳稻品种携带抗性基因Pita;绵恢501等5个籼稻品种(系)和粳稻品种武育粳7号、辽粳454携带抗性基因Pib。

【总页数】6页(P21-26)【关键词】水稻;稻瘟病;主栽品种;抗性基因;分子标记【作者】时克;雷财林;程治军;许兴涛;王久林;万建民【作者单位】中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程【正文语种】中文【中图分类】S511.034;S668.4【相关文献】1.黑龙江省种植品种中稻瘟病抗性基因Pib和Pita的分布 [J], 刘华招;刘延;刘化龙;徐正进;陈温福2.稻瘟病抗病基因Pita和Pib在中国水稻地方品种中的分布 [J], 杨杰;杨金欢;王军;范方军;朱金燕;曹卿;田胜尼;仲维功3.抗稻瘟病水稻资源抗性基因Pita、Pib、Pi9以及Pikm的分布研究 [J], 戴小军;杨远柱;周亮;梁满中;胡小淳;陈良碧4.6个稻瘟病抗性基因在浙江省主栽水稻品种中的分布和抗性评价 [J], 何海燕;邱海萍;柴荣耀;毛雪琴;王艳丽;孙国昌5.湄潭县水稻主栽品种稻瘟病抗性筛选研究 [J], 刘霞;周开云;江健;陈卓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。