心血管疾病标志物的新秀循环microRNA
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心血管疾病标志物的新秀循环 microRNA 心血管疾病是西方国家患病率和病死率第一位的疾 病。现在已有证据证实 microRNAs （ miRNA ）是调节包括心 血管疾病在内的许多疾病的关键调节因子。最近发现，通过 不同的载体， miRNA 可以传输至细胞外， 这一发现再次激起 了国内外学者的研究热情，通过检测循环中的 miRNA 可以 提供疾病诊断及治疗的信息。与传统的生物标志物相比，循 环 miRNA 有显著的优越性， 这种存在于细胞外的 miRNA 已 被证明能在循环血液中稳定存在，因此检测循环血液中的 miRNA 成为可能。 尽管部分 miRNA 精确的细胞来源还不十 分确定，但前期的研究已经证明了 miRNA 能作用于受体细 胞，并调节靶基因的转录并影响蛋白的合成。许多 miRNA 的表达是细胞或组织特异性的，而它们的表达水平也与相应 组织或细胞的病理或生理过程有关，异常的表达反应了机体 的病理状态。因此循环 miRNA 作为一种新的疾病标志物得 到了越来越多的重视。在正常人和肿瘤等疾病患者体内循环 miRNA 的表达谱存在明显的差异，因次，循环 miRNA 很可 能成为诊断疾病的非侵入的、准确的新型生物标志物，有广 阔的前景。 本综述将首先讨论循环 miRNA ，作为存在于细胞 外的核酸，在循环血液中是如何稳定存在并发挥调节作用 的。其次总结循环 miRNA 作为新型标志物在心血管及相关 领域的最新进展，包括：心肌梗死 [1] ，心力衰竭 [2] ，动脉粥 样硬化 [3] 和高血压 [4]等。
1miRNA 的发现 1972 年首次在血浆中发现了稳定存在的细胞外完整的 RNA,这种RNA不被RNA酶降解。这种细胞外的 RNA,包括 miRNA 一定有种保护机制能对抗降解。 这是 miRNA 首次被 发现，但当时并未意识到这种 miRNA 的重要作用。 大约 10 年前，在哺乳动物体内发现了一组非编码的小 RNA[5] ，在进化上相对保守。 miRNAs 作用于 mRNA 的 3' 非编码区在转录后水平调节基因表达。通过影响蛋白质的翻 译， miRNAs 在生物合成过程中起重要的调节作用。循环 miRNA 的意外发现开启了研究领域的新篇章， 使得我们有机 会深入了解这一极为活跃的生物标志物， miRNA 及时将细胞 内的信息传递给我们。意识到 miRNA 重要的调节作用后， 很快掀起了 miRNA 的研究热潮，在心血管领域的研究也是 持续升温。 miRNA 作为心血管疾病的标志物和治疗手段成为 研究的热点 [6]。 2 循环 MiRNA 的稳定性
2008 年， miRNA 的研究取得重大突破， Lawrie 等[7]于 2008年首次在淋巴瘤患者的血清中发现了细胞外的 miRNA 。 同年， Mitchell 等[8]在前列腺癌患者的血清及血浆中都发现 了这 种生物标志物。随后，多项研究证实了 miRNA 可以由 细胞输出至胞外，在体液中稳定存在，包括血浆、血清、唾 液、尿液、泪液甚至乳汁 [9-11] 。通过血浆、红细胞、血小 板、及有核细胞的检测发现血浆 miRNA 能稳定存在，即使 在各种严苛的条件下：高温至沸腾，强酸强碱，室温下长期 储存和反复冻融等 [7,8,12] 。已知细胞外裸露的 RNA 极易被 RNA 酶降解，而 miRNA 却出奇的稳定， 这说明内生的 miRNA 必然受到某种机制的保护而不被降解。研究证实 miRNAs 在 血浆中被有膜微颗粒包裹如胞外体、微囊泡和凋亡小体 [13,14] 或与 RNA 结合蛋白结合(如 Argonaute2 ， Ago2 蛋 白 )[15] 或者结合于载脂蛋白复合体(如 high-density lipoprotein ， HDL)[16] 通过这些方式的结合阻止降解。
3 循环 miRNA 的来源
El-Hefnawy 等[17] 首次提出血浆 RNA 通过包裹于蛋白 或脂质囊泡中而逃过 RNA 酶的降解。根据他们的体积及从 细胞中释放的方式，这些颗粒被分别命名为胞外体，微囊泡 或凋亡小体。胞外体直径 50~100nm，前体又称胞内体，胞 内体内含有由细胞核释放的 miRNA, 多个胞内体在胞浆中 形成多囊复合体，但各自有独立的包膜包裹，当多囊复合体 的膜与细胞膜融合时，这些小泡释放至胞外形成了胞外体。 微囊泡或脱落的微囊泡是另一种形式的带膜微粒 [18] ，是细 胞质膜脱落的产物，和胞外体一样，微囊泡也可以来源于不 同的细胞[19]，直径0.1〜1卩m,大于胞外体。两种带膜微 粒的产生机制也不相同 [20,21]。胞外体的形成是细胞的内吞 作用，并将内吞的囊泡融合成多囊泡（ MVBs ），而微囊泡的 形成是细胞自身的出牙过程 [22]。Hunter等于2008年首次在 微囊泡中发现了 miRNA[23] ，携带有 miRNA 的微囊泡同 样 能作用于受体细胞起到信息传递的作用。含有 miRNA 的微 囊泡在细胞凋亡时即可形成凋亡小体，细胞坏死或凋亡时这 种有膜结构的囊泡携带 miRNA 进入血循环 [22] 。 机体内富 含各种形状，大小（1〜5卩m）的微粒[24]。 除了细胞起源的囊泡包裹有 miRNA ,还有很大一部分细 胞外的 miRNA 并不是存在有膜结构中，而是与蛋白结合， 其中包括核仁磷酸蛋白 （ nucleophosmin ， NPM1 ） [25]， Ago 蛋白家族的 Ago2，还有Ago1 , Ago3 , Ago4。最近有报道 细胞外的 miRNA 还可以通过高密度脂蛋白转运 [26,27]，可 见细胞内 miRNA 的载体非常丰富， 通过结合载体 miRNA 能 在血浆微粒中稳定存在，越来越多的证据显示这种血浆中的 miRNA 并不单纯是被动的释放， 而是在细胞与细胞之间发挥 重要的信息传递的功能， miRNA 微粒通过血液循环作用于远 处的靶细胞，并实现对靶细胞基因表达的调节 [28,29]。见图 1。 图 1 循环 miRNA 的释放及细胞间的传递 图1在细胞核内，在RNA聚合酶H (polymerase H, Pol H)的作用下生成具有茎环结构的 miRNA的前体(primary
miRNA，Pri-miRNA )。Pri-miRNA 输出至胞浆中，被 Dicer 核酸酶切割成双链 miRNA。 miRNA 双链解离形成成熟的 miRNA ，其中一条链与 Ago 蛋白结合形成 RNA 介导的沉默 复合体( RNA- induced silencing complex RISC )，另一条降解。 RISC 可在胞浆内结合靶 mRNA ，抑制靶基因的翻译或诱导 降解。 另外， miRNA 可以输出至细胞外， 输出的载体包括胞 外体、微囊泡、 RNA 结合蛋白( miRNA-binding protein complexes, RBP) 或高密度脂蛋白 (high density lipoproteins , HDL )。输出至胞外的 miRNA 可以作用于受体细胞调节受体 细胞基因的表达。实现细胞之间信息的传递及调控。 4 循环 miRNA 作为标志物
一直以来，人类理想的生物标志物应符合以下条件：① 可以通过非侵入性操作获得，②具有高度的敏感性及特异 性，③在疾病的早期阶段即能诊断。④随着疾病的转归，呈 现相应的指标改变。⑤在样本中的半衰期长，⑥检测方法简 便，便于快速检测 [30] 。循环 miRNA 在血浆中存在的稳定性 及可以定量检测的的特性引起了科研工作者的极大兴趣。由 于循环 miRNA 满足了人类对循环标志物的全部幻想，应用 前景十分广阔，自 2009 年开始相继有 10 多项研究先后报道 了循环 miRNA 作为心血管系统的血浆标志物，用于诊断及 预后评价。其中包括心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化和 高血压等。尽管以上的结果还需要大规模多中心的研究进一 步验证，但以上的研究至少证实了部分血浆 miRNA 的心血 管特异性。不但能用于心血管疾病的诊断及疗效观察，而且 为临床研究提出了新的治疗终点。关于心血管疾病中的 miRNA 标志物的研究汇总见表 1 5 急性心肌梗死与循环 miRNA 曾经设想存在一种心肌细胞特异性的 miRNA ，在心肌损 伤时快速释放入循环血液中，可以通过这种特异的 miRNA 准确的诊断心肌损伤。这一设想正在逐步实现。目前已经发 现在急性心肌梗死时有 4 种 miRNA 特异性升高。分别是 miR-208a, miR-499, miR-1, 和 miR-133[1,31-38] 。 其中 miRNA-208a编码a -MHC基因内含子，是目前发现的最为 特异性的心肌来源的 miRNA[39] ，在心肌以外的组织没有发 现。而其他 3 种 miRNA(miR-499 ， miR-1， miR-133) 除了存 在于心肌细胞，在骨骼肌中也发现一定水平的表达 [40,41] 。 一项研究 [1]纳入了 66 例胸痛患者，均进行了心肌酶、 心电图检查，并进行了冠脉造影，同时纳入了 30 例健康对 照。66 例胸痛患者均完成了上述检查确诊心肌梗死患者为 33 例，另外 33 例为非心梗的胸痛患者。时时荧光定量 PCR 显示 miR-1 ， miR-133a 和 miR-499 血浆水平在心梗组显著升 高，对比非心梗胸痛组和健康对照组均有统计学差异。 miR-208a目前发现的唯一的心脏特异性的 miRNA，在非心 肌组织中未发现表达，因此是诊断急性心肌梗死最为理想的 生物标志物。另有几项研究显示 miR-499 在急性心肌梗死中 的诊断价值 [1,31,33,36] 。与 miR-208a 相比， miR-499 的优势 在于检测的稳定性， miR-499 的释放晚于 miR-208a 和 cTnI， 因此在诊断晚期心梗更有价值。 miR-1 和 miR-133a 由于在骨 骼肌高表达，血浆水平受到骨骼肌和其他组织病理变化的影 响，作为心肌
