酶的提取与分离纯化

第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。

◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。

1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。

表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。

常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。

机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。

1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。

物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。

常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。

(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。

常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。

(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。

1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。

常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。

有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。

表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。

1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。

木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。

其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。

2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。

然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。

3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。

4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。

5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。

6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。

其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。

7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。

8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。

需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。

同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。

总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。

通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。

第一章酶的分离提取与纯化1.1离心分离和层析分离1.1.1酶的提取方法离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。

离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

1.1.1.1离心机的种类与用途常速离心机，高速离心机，超速离心机1)常速离心机：转速<8000r/min用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒2)高速离心机：转速：1~2.5*104r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器3)超速离心机：转速：2.5~12*104r/min用途：用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化1.1.1.2离心方法差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗粒分不分离的方法。

用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

常用介质：蔗糖、甘油3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。

介质：铯盐1.1.1.3层析分离技术又称色谱技术，是一种物理的分离方法。

利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离根据分离原理分类吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等1)吸附层析原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。

2)分配层析原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。

Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。

一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。

二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。

若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。

要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。

细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。

在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。

1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。

（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。

（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。

（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。

大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。

2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。

（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。

如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。

但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。

（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。

使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。

可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。

酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。

溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。

从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。

它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。

可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。

2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。

离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。

由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。

该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。

酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。

为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。

在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。

二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。

2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。

此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。

如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。

其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。

酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。

因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。

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1. 细胞破裂。

机械法，例如匀浆、研磨。