荧光法荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。
2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。
3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。
（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。
5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。
（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。
（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。
（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。
磷光的坡长比荧光更长。
9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。
激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S1的最低振动能级。
②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。
③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。
10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
