No.109
TSKgel STAT系列色谱柱
—目录—
页码
1. 前言 1
2. 色谱柱的基本特点 1
2-1. 填料特点 1
2-2. 柱压 2
2-3. 标准蛋白质的分离 2
2-4. 核酸的分离 4
2-5. 样品载量 5
3. 阴离子交换色谱柱的应用实例 6
4. 阳离子交换色谱柱的应用实例10
5. 总结14
1. 前言
离子交换色谱法是一项广泛应用于生物制药、生物化学和食品工业等领域的分析技术，其可以轻松地对生物大分子样品（例如蛋白质和核酸）进行分离和定量分析。离子交换色谱包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱，前者使用带季胺或叔胺基团的填料，后者使用带磺酸或羧酸基团的填料。可以根据目标蛋白质的化学性质、空间立体构造、等电点，或者根据与杂质组分间的不同分离选择性，选择最适填料装填的离子色谱柱。核酸一般采用阴离子交换色谱柱进行分离分析。东曹离子交换色谱柱包括TSKgel 5PW系列和TSKgel NPR系列产品，前者使用一种多孔性填料，可用于实验室规模的分离和纯化工作，后者使用非多孔性填料（粒径：2.5μm），适用于高速、高分辨率和微量分析。
无论是不同粒径的TSKgel PW系列高速分析、中高压制备填料，亦或是工业生产制备用TOYOPEARL系列的中低压层析填料，其填料基质的化学组成和骨架构造都是一致的，因此实验室规模下使用TSKgel 5PW系列色谱柱优化获得的分离条件可以很容易地规模放大到生产级别。
TSKgel NPR系列色谱柱使用非多孔性填料（粒径：2.5 μm），因此尤其适用于高分辨率和高通量的分析。此外，该类色谱柱对低浓度的肽和蛋白质样品分离、分析时，亦可获得良好的回收率。
最近推出的TSKgel STAT系列色谱柱，使用非多孔性填料，能够实现在较低柱压下获得与TSKgel NPR系列色谱柱相同或更好的保留及分辨率。本报告将详细介绍TSKgel STAT系列色谱柱的基本特点和部分应用实例。
2. 色谱柱的基本特点
2-1. 填料特点
TSKgel STAT系列色谱柱包括导入了季胺基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel Q-STAT阴离子交换色谱柱和TSKgel DNA-STAT阴离子交换色谱柱，可以提供10、7和5μm 多种粒径选择；包括导入了磺酸基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel SP-STAT强阳离子交换色谱柱，可以提供10和7μm的两种粒径选择；还包括导入了羧酸基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel CM-STAT弱阳离子交换色谱柱。这些色谱柱的规格和特点详见表1。
TSKgel STAT系列色谱柱包括尺寸为3.0 mm I.D.×3.5 cm 的、设计用于进行1至2分钟内完成分析的高通量色谱柱（粒径10μm：高通量色谱分析柱）；包括尺寸为4.6 mm I.D.× 10 cm的、设计用于进行高分辨率分析的色谱柱（粒径7μm：高分辨率色谱柱）。由于该类色谱柱使用的填料基质的机械强度高，填料几乎不会因溶剂改变而发生收缩或膨胀，所以也可以使用添加了有机溶剂的洗脱条件。在洗脱液中适当添加有机溶剂，可以有效抑制高疏水性样品的吸附，从而加快洗脱速度。此外，也可以通过在洗脱液中适当添加有机溶剂，有效清洗和去除实际样品分析中吸附在色谱柱填料上的污染物质。
表1 . TSKgel STAT系列色谱柱填料特点
2-2. 柱压
图1显示了不同填料装填的几种高分辨率色谱柱在不同柱温下的柱压变化情况。数据表明，在标准流速下（1.0mL/分），即使在低柱温范围内，各种色谱柱的柱压也不过在10MPa 左右。这为在耐压较低的HPLC 系统下使用这些色谱柱提供了可能。
图1. 柱温与柱压的关系
色谱柱：TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
TSKgel SP-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm) TSKgel CM-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：10 mmol/L 醋酸钠缓冲液 (pH 5.0)
(TSKgel SP-STAT, TSKgel CM-STAT) 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.5) (TSKgel Q-STAT)
流速： 1.0 mL/min
2-3. 标准蛋白质的分离
图2 和图3显示了使用TSKgel NPR 系列色谱柱（粒径：
2.5μm ）与高分辨率STAT 色谱柱分离蛋白质的对比。由于填料表
面修饰技术的改进，TSKgel STAT 系列色谱柱可以获得比传统
TSKgel NPR 系列色谱柱更强的保留能力，而且无论填料粒径大小差异，两种色谱柱均可以获得峰形尖锐的高分辨率分离分析效果。显然，由于使用了不同的离子交换基团，TSKgel SP-STAT 和TSKgel CM-STAT 色谱柱在分离选择性方面亦有所不同。
图2. 阴离子交换色谱柱在标准蛋白质中的分离结果比较
色谱柱： TSKgel DEAE-NPR
(4.6 mm I.D.× 3.5 cm)（上）
TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm) （下）
洗脱液： A ：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.5)
B ：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.5)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.0 mL/ min 检测： UV (280nm) 温度： 25℃ 进样量： 各0.6μg
样品： 1. 伴清蛋白 2. 卵清蛋
3. 胰蛋白酶抑制剂
图3. 阳离子交换色谱柱在标准蛋白质中的分离结果比较
色谱柱：TSKgel SP-NPR (4.6 mm I.D.× 3.5 cm)（上）
TSKgel CM-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)（中） TSKgel SP-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)（下）
洗脱液： A ：10 mmol/L 磷酸钠缓冲液 (pH 6.2) B ：0.5 mol/L NaCl + 10 mmol/L 磷酸钠缓冲液 (pH 6.2) 线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟 流速： 1.0 mL/ min 检测： UV (280nm) 温度： 25℃
进样量： 各10 μg 样品： 1. α-胰凝乳蛋白酶原 A
2. 细胞色素 C
3. 溶菌酶
图4、5和6显示了使用10μm粒径填料装填的高通量色谱柱的高速分析比较结果。图4是TSKgel Q-STAT高通量色谱柱与整体型（Monolith）阴离子交换整体柱的分离比较结果。相对于整体柱，TSKgel Q-STAT高通量色谱柱可以在1分钟内完成3种标准蛋白质的分离，并且具有更佳的色谱峰形。
图4. 标准蛋白质的阴离子交换色谱柱的高通量分析
色谱柱：市售阴离子交换整体柱(5.0 mm I.D.× 5 cm) （上）TSKgel Q-STAT (3.0 mm I.D.× 3.5 cm) （下）
洗脱液：A：20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 0% → 100%, 1分钟
流速： 2.0 mL/ min（整体柱）
1.0 mL/ min (TSKgel Q-STAT)
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量：各3μg
样品： 1. 伴白蛋白
2. 卵清蛋白
3. 胰蛋白酶抑制剂
* 使用了微混合器
图5是TSKgel SP-STAT高通量色谱柱与阳离子交换整体柱的分离比较结果。相对于整体柱，TSKgel SP-STAT高通量色谱柱可以在1分钟内完成3种标准蛋白质的分离，并且具有更佳的色谱峰形。
图5. 标准蛋白质的阳离子交换色谱柱的高通量分析
色谱柱：市售阳离子交换整体柱(5.0 mm I.D.× 5 cm) （上）TSKgel SP-STAT (3.0 mm I.D.× 3.5 cm) （下）
洗脱液：A：20 mmol/L 醋酸钠缓冲液(pH 5.0)
B：1.0 mol/L NaCl + 20 mmol/L
醋酸钠缓冲液(pH 5.0) (TSKgel SP-STAT)，
1.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
醋酸钠缓冲液(pH 5.0) (整体柱)
线性梯度：B 0% → 100%, 1分钟
流速： 4.73 mL/ min（整体柱）
2.0 mL/ min (TSKgel SP-STAT)
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量： 5 μL
样品： 1. α-胰凝乳蛋白酶原 A 1 g/L
2. 细胞色素C 1 g/L
3. 溶菌酶 1 g/L
* 使用了微混合器
2-4. 核酸的分离
图6为使用TSKgel Q-STAT 高通量色谱柱在1分钟内分离6种核苷酸的色谱图。
使用不同的梯度时间对二磷酸胞苷（CDP ）和三磷酸胞苷
（CTP ）两种核苷酸进行了分离。图7为以这两种核苷酸间的分
辨率（分离度）为纵坐标，CTP 的洗脱时间为横坐标绘制而成的分析图。从图中可以看出，即使使用高分辨率色谱柱，其分辨率也会随梯度时间缩短而下降，但很显然，即使CTP 的梯度洗脱时间很短时（本例为2.5分钟），使用该种高通量色谱柱仍然可以获得优异的分辨率和分离效果。
图8为使用高分辨率色谱柱对15种核苷酸进行同时分离的色谱图。
综合以上结果可以看出，对于核酸的分析，可以根据所要求的分析时间或者分辨率做出对TSKgel STAT 色谱柱的最适选择。
图6. 阴离子交换色谱柱核苷酸的高通量分析
色谱柱： TSKgel Q-STAT (3.0 mm I.D.× 3.5 cm)
洗脱液： A ：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.5) B ：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L Tris-HCl 线性梯度：B 0% → 100%, 1 分钟
流速： 2.0 mL/ min 检测： UV (260 nm) 温度： 25℃ 进样量： 5 μL 样品：
1. 胞嘧啶核苷 0.05 g/L
2. 3’,5’-Cyclic CMP 0.1 g/L
3. 2d-CMP 0.1 g/L
4. CMP 0.15 g/L
5. CDP 0.2 g/L
6. CTP
0.25 g/L
图7. 高通量和高分辨率色谱柱的洗脱时间与分辨率变化关系
色谱柱： TSKgel Q-STAT (3.0 mm I.D.× 3.5 cm)
TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
图8. 阴离子交换色谱柱对15种核苷酸的同时分析
色谱柱： TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm) 洗脱液： A ：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.5)
B ：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.5) 线性梯度：B 0% → 50%, 60分钟
流速： 1.5 mL/min 检测： UV (260 nm) 温度： 25℃ 进样量： 5 μL
样品： 核酸碱基 各 0.05 g/L
单磷酸型 各 0.1 g/L 二磷酸 型 各 0.15 g/L 三磷酸 型 各 0.2 g/L
2-5. 样品载量
TSKgel STAT系列色谱柱由于使用了非多孔性填料，其填料比表面积要比多孔性填料小，因此与多孔性填料装填的色谱柱相比，在进样量较低时，色谱柱分辨率受进样量大小的影响程度更为显著。
图9. 进样量与半峰宽的关系
色谱柱：TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：A：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.0 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量： 5 μL
样品：卵清蛋白
图9和图10阐明了进样量与色谱柱分辨率之间的关系。结果表明，约10μg以下的进样量对TSKgel STAT系列的阴离子交换色谱柱和阳离子交换色谱柱是比较合适的。
图10. 进样量与半峰宽的关系
洗脱液：A：20 mmol/L 醋酸钠缓冲液(pH 5.0)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
醋酸钠缓冲液(pH 5.0)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.0 mL/ min
检测：UV (280 nm).
温度：25℃
样品：细胞色素 C
3. 阴离子交换色谱柱的应用实例
图11是对市售脂肪酶粗品的分离实例。显然，与TSKgel DEAE-NPR相比，TSKgel Q-STAT色谱柱可以获得更强的保留和更佳的分辨率，其色谱峰形更为尖锐。
图11. 市售脂肪酶粗品的分离结果比较
色谱柱：TSKgel DEAE-NPR (4.6 mm I.D.× 3.5 cm) （上）TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)（下）
洗脱液：A：20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.0 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量：10 μL
样品：市售脂肪酶粗品
图12是对市售牛血清白蛋白（BSA）酶解标准品的分离实例。显然，与TSKgel DEAE-NPR和另一款商品化的WAX色谱柱相比，TSKgel Q-STAT可以获得更多的分离色谱峰信息，流穿的组分更少（图中椭圆标记区域）。
图12. 市售BSA 酶解标准品的分离结果比较
色谱柱：TSKgel DEAE-NPR (4.6 mm I.D.× 3.5 cm) （上）商品化WAX色谱柱(4.0 mm I.D.× 25 cm)（中）
TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm) （下）
洗脱液：A：20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.5 mL/ min
检测：UV (220 nm)
温度：25℃
进样量：10 μL
样品：市售BSA 酶解标准品(Waters, Co.) 10 μL
TSKgel DEAE-NPR
TSKgel Q-STAT
商品化WAX色谱柱
Peak
No. 32
Peak
No. 15
Peak
No. 42
0 2 4 6 8 min
图13是对含有单克隆抗体（MAb）的小鼠腹水样品进行分离的结果。上方为使用TSKgel Q-STAT色谱柱对小鼠腹水分离的色谱图，很明显，抗体和白蛋白组分很好地得到了分离。下方为使用TSKgel Q-STAT色谱柱对小鼠腹水纯化而来的单抗样品的分离色谱图，很显然，纯化后的单抗样品中存在多个色谱峰。
图13. 含有单抗的小鼠腹水和纯化后的单抗样品的分离
色谱柱：TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：A：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.0 mL/min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量：10 μL
样品：稀释10倍的含有单抗的小鼠腹水（上）
纯化后的小鼠单抗（下）
样品使用洗脱液 A 稀释10倍后，进样10 μL。
图14为使用更加平缓的线性梯度分离图13中纯化后的单抗样品的色谱图。结果表明，纯化后的单抗样品中仍然存在离子相互作用不同的多种电荷异构体。可以通过缓慢的、精细的线性梯度洗脱，实现这些电荷异构体组分间的良好分离。
图14. 纯化后的单抗电荷异构体的分离
色谱柱：TSKgel Q-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：A：0.05 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
B：0.15 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 25% → 100%, 30分钟
流速： 1.0 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
样品：纯化后的小鼠单抗
图15和图16为1kb DNA分子量标准物的核酸分离实例。样品中含有碱基对从75bp到12,216bp的23种不同长度的DNA片段。结果表明，使用TSKgel DNA-NPR色谱柱时，
B：2.0 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)
线性梯度：B 37.5% → 50%, 20分钟
(TSKgel DNA-STAT)
B 25% → 37.5%, 20 分钟
(TSKgel DNA-NPR)
流速：0.75 mL/ min
检测：UV (260 nm)
温度：25℃
进样量： 2 μL
样品：1kb间隔的DNA分子量标准物这种分离条件对于分析第20个及以上的DNA片段（碱基对>9,126 bp）并不合适。但使用TSKgel DNA-STAT色谱柱进行同样的分析时，样品中的所有DNA片段都得到了良好分离，并且分辨率均大于1.5。
图16. 图15的放大
另一方面，如图17所示，由于TSKgel DNA-NPR色谱柱对分析长度相同、碱基序列不同的短链DNA片断（含26个碱基的PCR引物）具有极佳的分离选择性，因此应根据样品情况及分析目的选择TSKgel NPR系列色谱柱或者TSKgel STAT系列色谱柱。
图17. PCR引物的分离结果比较
色谱柱：TSKgel DNA-NPR (4.6 mm I.D.× 7.5 cm) （上）TSKgel DNA-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)（下）
洗脱液：A：20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
B：0.75 mol/L NaCl + 20 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)
线性梯度：B 50% → 75%, 25分钟
流速：0.8 mL/ min
检测：UV (260 nm)
温度：25℃
进样量：10 μL
样品浓度：各10μmol/L
样品：含26个碱基的PCR引物
1. 5'-TAATTAAGGACTCCGTTCTTCTATAT-3'-NH2
2. 5'-TCTTTACTTTAGTCACAAAGCGATAA-3'-NH2
3. 5'-GACTCCGTTCTTCTATATTTTCGAGG-3'-NH2
4. 5'-GGACGTGCTGGGTGTCTTCTCCGTCG-3'-NH2
4. 阳离子交换色谱柱的应用实例
图18为使用阳离子交换色谱柱对单抗电荷异构体的分离实例。结果表明，该类色谱柱对电荷略有差异的异构体可以获得极佳的分离效果。比较而言，TSKgel CM-STAT色谱柱可以获得更为尖锐的色谱分离峰、分辨率更高。
图18. 纯化后的单抗电荷异构体的分离（盐浓度梯度洗脱）
色谱柱：TSKgel CM-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)（上）
TSKgel SP-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)（下）
洗脱液：A：20 mmol/L MES缓冲液(pH 6.0)
B：0.1 mol/L NaCl + 20 mmol/L
MES缓冲液(pH 6.0)
线性梯度：B 25% → 55%, 30分钟
(TSKgel SP-STAT)
B 20% → 50%, 30 分钟
(TSKgel CM-STAT)
流速： 1.0 mL/min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量：10 μL
样品浓度：1 g/L
样品：纯化后的单抗
此外，如图19所示，利用pH梯度洗脱，TSKgel CM-STAT 色谱柱同样可以进行单抗电荷异构体的分离分析。
图19. 纯化后的单抗电荷异构体的分离（pH梯度洗脱；色谱聚焦）
色谱柱：TSKgel CM-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：A：50 mmol/L 酸钠缓冲液(pH 5.0)
B：30 mmol/L 醋酸钠缓冲液（未调整pH 值）
使用A液对色谱柱进行平衡，进样后，逐步过渡至
100%的B液进行洗脱。
流速： 1.0 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量：10 μL
样品浓度：1 g/L
样品：纯化后的单抗
研究人员正在研究使用聚乙二醇对蛋白质进行修饰（PEG 化）以延长蛋白药物的体内半衰期。图20和图21为使用TSKgel SP-STAT高通量色谱柱对聚乙二醇修饰溶菌酶的反应过程跟踪分析。图20是PEG化反应开始后，一定时间取样分析后的叠加色谱图。图21是以各色谱图峰面积的百分比为纵坐标，反应时间为横坐标所获得的反应过程变化跟踪结果。
图20. 溶菌酶PEG化反应的跟踪色谱图
色谱柱：TSKgel SP-STAT (3.0 mm I.D.× 3.5 cm)
洗脱液：A：20 mmol/L 酸钠缓冲液(pH 5.0)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
醋酸钠缓冲液(pH 5.0)
线性梯度：B 0% → 100%, 1.5分钟
流速： 2.0 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
样品：将5g/L的溶菌酶溶解于磷酸盐缓冲液中，并添加3倍摩尔当量的聚乙二醇修饰试剂（ME-200CS;日本油脂
公司产品）。每4分钟取样进行分析。
由于高通量色谱柱的分析时间大为缩短，因而保证了该类色谱柱可以及时跟踪如PEG化修饰这样的快速反应中的变化情况。
此外，如图22所示，还可以使用TSKgel SP-STAT这样的高分辨率色谱柱进行单、双和三聚乙二醇修饰后的蛋白质多种异构体的精密分离分析。
图21. 溶菌酶PEG化过程中各洗脱峰面积百分比变化跟踪图
图22. 溶菌酶PEG化反应物的色谱分析图
色谱柱：TSKgel SP-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：A：20 mmol/L 酸钠缓冲液(pH 5.0)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
醋酸钠缓冲液(pH 5.0)
线性梯度：B 0% → 100%, 10分钟
流速： 1.4 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量： 5 μL
样品：图20中最后一次的反应物
图23是一种市售PEG化蛋白药物的分析色谱图。同时，收集各组分峰进一步进行了SDS-PAGE电泳分析，结果如图24所示。
图23. 市售PEG化蛋白药物的分析
色谱柱：TSKgel SP-STAT (4.6 mm I.D.× 10 cm)
洗脱液：A：20 mmol/L 醋酸钠缓冲液(pH 4.2)
B：0.2 mol/L NaCl + 20 mmol/L
醋酸钠缓冲液(pH 4.2)
线性梯度：B 0% → 100%, 20分钟
流速： 1.5 mL/ min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
样品：市售PEG化蛋白药物
SDS-PAGE电泳分析结果也表明，PEG化蛋白药物中确实含有未分离的多个组分。TSKgel SP-STAT色谱柱可以用于PEG药物生产中的过程控制及产品质量控制。
194kda
116kda
95kda
51kda
36kda 123456789101112
图24. 市售PEG化蛋白药物洗脱组分的SDS-PAGE电泳分析结果
* 非还原SDS-PAGE电泳
泳道1、12：分子量标记物
泳道2：市售PEG化蛋白药物
泳道3至11：图22所示峰组分
图25为使用TSKgel CM-STAT高分辨率色谱柱对一些市售抗体药物分离的色谱图。各抗体药物异构体在短时间内便得到了很好的分离。结果清楚地表明，TSKgel CM-STAT色谱柱完全适用于抗体药物的研发及品质管理。
图25. 抗体药物异构体的分析
色谱柱：TSKgel CM-STAT (4.6 mm I.D. × 10 cm)
洗脱液：A：20 mmol/L MES 缓冲液(pH 6.0)
B：0.5 mol/L NaCl + 20 mmol/L
MES缓冲液(pH 6.0)
线性梯度：B 10% → 30%, 15 分钟
流速： 1.0 mL/min
检测：UV (280 nm)
温度：25℃
进样量：20 μL
样品浓度：0.5 g/L
样品：A：人源化抗体，IgG1
B：人源化抗体，IgG1
C：嵌合抗体，IgG1
D：嵌合抗体，IgG1
E：嵌合抗体，IgG1
* 本数据为日本相模中央化学研究所Hitoshi Kakidani教授惠赠。
5. 总结
迄今为止，非多孔性填料装填而成的TSKgel NPR系列离子交换色谱柱已被广泛应用于蛋白质和核酸等的高分辨率分离分析。然而，在一些情况下，该系列色谱柱存在柱压过高、对低分子量组分的分析峰形较差的不足之处。TSKgel STAT系列离子交换色谱柱，由于其填料基质的特点及表面修饰技术的改良，对低分子量组分的分析峰形得到改善。加之对填料粒径的优化处理，该系列色谱柱更可以在较低的柱压下实现高分辨率的分离分析。此外，该系列色谱柱的上市，更加充实了东曹公司高分辨率、高通量离子色谱柱的产品链，因此应用范围必将更为广泛。
*本报告中使用的以下名称是东曹公司的商标：TSKgel、TSKgel STAT
Sephadex G10 凝胶色谱柱 在药物质量控制中的应用 （大连依利特公司应用实验室） 1.前言 目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。 在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。 中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述 中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。 以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
凝胶色谱柱操作 1、溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。 2、装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品
离子交换色谱 一、实验原理： 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 二、实验设计 离子交换剂；缓冲液；洗脱剂 具体操作： 1、离子交换介质的选择： 考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。 对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透 析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。以此类推，直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止，也可用阳离子交换剂作类似的选择，不过要注意，pH 的改变应向减小的方向进行。 功能集团的强弱 一般情况下，在分离等电点pH为6-9的目的分子，尤其是当目的分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。 流动相(缓冲液)的选择： 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对 pH有一定缓冲作用的溶
装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。 .交联葡聚糖：葡聚糖凝胶颗粒的商品名，用于凝胶过滤，其大小不同颗粒可用于对各种不同原子量的物质进行分离，作分子筛色谱法介质 这是葡聚糖凝胶，G后面的数字代表凝胶颗粒的大小。具体操作详见，说明书啊！但是G-200的分离范围好像也不大啊，只有20万 Sephadex G-100 对多糖的分离范围最大直到10万，而多糖大于十万的多得是呢 只适用于水中应用，不同规格分离不同分子量范围的化合物。 sephadex g25 g25是什么意思？ 参考见解：Cross-linked dextran gel G-25,葡聚糖凝胶G-25,白色珠状颗粒。一种由葡聚糖经醚键相互交联合成具有多孔性三度空间网状结构的高分子分离材料，为稳定的亲水性凝胶，G-10是表示G类凝胶吸水量的型号。可将G后的数字除以10即为该凝胶每克干重所吸水分的毫升数。能使一定分子量范围的大分子进入凝胶的网状结构内，不溶于水、盐分离和提纯蛋白质、多糖、酶、核酸、激素、氨基酸、多酞和抗菌素等。 比较基础，适合新虫学习！ 一、装柱
液相色谱仪色谱柱使用及 维护 Prepared on 22 November 2020
液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内
5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会
亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 3.HILIC影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同 的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗 粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在 凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过 程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分 子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后 流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大， 完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应 的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变 凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子， 在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而 分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小
前言 液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以 固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护 色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有: (1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。 (2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。 (3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。 (4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。 (5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。 2 色谱柱的使用 新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。 硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净后,再用流动相平衡。 实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。 3 色谱柱的清洗与保存 色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用90 %甲醇冲洗30～60min ,若含酸、碱、盐类物质,则要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同的
简介 凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。 一、分离原理 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量
常用色谱柱简介 气相色谱毛细柱 （键合，聚二甲基硅氧烷） HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB， Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1 类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用 温度：-60℃-320℃ 应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍 生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱 醇，香料，咖啡，食品添加剂等。 (键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷) 对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱 类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷） 应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘 对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB， 油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5 镇痛药，除草剂等。 类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度： -60℃-320℃ PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱
应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷) 酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联 对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5， 苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525， 生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625） 生物碱，防腐剂，香料等。 类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃ 应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱 含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。 (键合,聚乙二醇二万) 对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱 HP-INNO Wax,AT-Wax (键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷) 类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温 对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃ BP-10，CPSil19CB 应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚， 类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280 乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代 ℃ 烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，
COSMOSIL高效液相色谱柱使用说明书 一. 序言 非常感谢您购买我们的COSMOSIL色谱柱。为了保证色谱柱能够发挥最高性能和保持更长的寿命，我们建议您在使用前仔细阅读本说明书。 COSMOSIL色谱柱由不锈钢制成，其内部填料以超纯多孔球状硅胶为基质。我们的COSMOSIL系列覆盖了几乎所有的正反相色谱的一般应用和特殊应用，此外还具有分析目的和制备目的的色谱柱。请联系我们的经销商或直接联系Nacalai Tesque咨询最适合您的色谱柱。 二. 使用注意 1. 避免冲击和震动。 2. 按照标签上标明的方向连接色谱柱。 3. 将色谱柱连接到检测器之前，先使用20~30ml流动相通过色谱柱。 4. 请使用完全脱气的流动相。气泡会导致检测噪音并且会加速色谱柱的恶化。 5. 请使用HPLC级溶剂。 6. 包装盒内的检验报告书中记载了色谱柱出厂时的内部溶剂成分。给流动相中添加缓冲液 时，请确认检验报告书中的成分表以避免色谱柱内产生沉淀。 7. 请将流动相的pH值范围保持在2~7.5之内。缓冲液浓度范围通常为0.005~0.02M。使用 流动相前先将流动相通过孔径0.5μm以下的薄膜滤器。使用三氟乙酸时，请将浓度保持在0.1%以下。 8. 请将压力保持在200kgf/cm2以下。在使用高粘度流动相时需要特别注意。 9. 使用完反相色谱柱后，请先用不含酸或盐的溶剂清洗色谱柱，再用乙腈或甲醇清洗色谱 柱，紧栓保存。 10. 使用完正相色谱柱后，请将色谱柱内部的溶剂置换为无卤素非极性溶剂（如正己烷或正 庚烷），紧栓保存。 11. 注入样品前请务必过滤样品。另外，将样品注入到流动相内时，请注意不要产生沉淀。 12. 拆下色谱柱的端螺帽或端部滤片会造成色谱柱性能的大幅下降。 13. 不要将螺帽拧的太紧。 14. 使用制备柱时，请先使用分析柱确定样品的分离状态。注意：可能会有保留时间长于目 标物质或无紫外吸收的杂质存在。
一、实验目的： 1. 掌握PL—120型号凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）的工作原理。 2. 掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。 3. 利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。 二、基本原理： 分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。 凝胶色谱的分离机理众说不一，有体积排除、限制扩散、与流动分离等各种解释。实验证明，体积排除的分离机理起主要作用。因此，这一技术又被赋予另一个名称：体积排除色谱（size exclusion chromatography，SEC） 、 图1. GPC分离过程示意图 圆球表示颗粒；黑点表示溶质分子 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入
色谱柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 5、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。 6、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要
拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置或更长时间。 7、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出 1-2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5-30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。 8、新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会
第七节离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换
剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子； 待分离的目标分子；▲需除去的杂质 1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平 衡色谱柱，以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、
一.安装、启用和维护中重点注意事项 色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。 1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。
2. 溶剂的匹配转换 色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。 3. 新柱使用前的平衡和老化 厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。 4. pH使用范围 一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大
亲水作用（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显着增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显着的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示： Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin. 另外，HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大的物质后出峰。如图3所示：
阴离子交换柱使用手册 注意 Chrompack IonoSpher A色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。 在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。 1．简介 Chrompack IonoSpher A 柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。 2．色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。 在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 3．洗脱液 推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，
例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。 绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。 洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。 一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。 4．流量和压力 注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi 增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。 拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。
【分享】色谱柱使用操作规程-sop 1.目的： 建立色谱柱使用操作规程. 2.范围：适用于仪器分析（HPLC、GC）前对检测条件适用性的确认和HPLC分析结束后对的色谱柱的清洗。 3.责任：QC检验员对本标准实施负责. 4.内容： 4.1. 系统适用性试验的定义：按SOP项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 4.1.1.色谱柱的理论板数（n）: n=5.54(tR/Wh/2)2 TR—保留时间，min； Wh/2—半峰宽高度。 4.1.2.分离度： tR2—为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1—为相邻两峰中前一峰的保留时间； W2及W1—为此相邻两峰的峰宽。 4.1.3.重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％。4.1.4.拖尾因子： W0.05h--为0.05峰高处的峰宽； d1—为峰极大至峰前沿之间的距离； 除另有规定外，T应在0.95—1.05之间。 4.2步骤： 4.2.1.按具体分析方法操作，用流动相走基线约40分钟（正常流速），待基线平稳。 4.1. 5.基线平稳后，按要求进系统适用性溶液或对照溶液分析，记录色谱图，进行评估，符合要求后，待测样品。 4.1.6.进样品溶液，记录结果。 4.1.7.测试完毕后，清洗约30min，一般流速为正常测样流速的1至1.5倍，冲洗约40min。 走空白，按1000积分无任何杂质显示。当所测样品杂质在30min 后出峰时，走空白时间约为60min。如果有杂质显示，继续清洗