凝胶色谱柱操作上课讲义

凝胶色谱的讲义第一章(1)第一章前言一、高聚物及多糖平均分子量及其分布1、高聚物的平均分子量除天然聚合物外，合成聚合物都是以单体为原料经过聚合反应而制得的。

每个聚合物分子都是由数目很大的单体分子加成或缩合而成，所以合成聚合物的分子量比单体要大千百倍甚至成万倍。

另一方面，根据绝大多数的聚合反应机理预示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是说每个聚合物分子可以由不同数目的单体分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，这种现象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。

高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要复杂一些，拿一个高聚物试样来说，由于试样内包含有许许多多个高分子，这些高分子的分子量可以分布在相当大的范围内。

例如，试样中可以包含尚未聚合的单体、含二个、三个、四个、…单体的低聚物以及聚合度不同的高分子，对这样一个多分散的体系来说，我们要表征它的分子量就需要用统计的方法，求出试样分子量的平均值和分子量分布、由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量；例如，某一个高聚物试样中含有N1个分子量为M；的分子，N2个分子量为M2的分子，N3个分子量为M3的分子，……Ni-1个分子量为Mi-1的分子以及Ni个分子量为MI 的分子，我们就可以根据定义算出它的各种平均分子量。

下面是四种最常用的平均分子量定义：这里：YMx分子量名称Mn数均分子量1Mw重均分子量2MzZ均分子量3MZ+1Z+1均分子量Mw/Mn分子量分布Mp峰位分子量另外，粘均分子量：很显然，同一个试样应用不同的统计方法所算出来的不同种类的平均分子量的数值是不同的。

一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：Mz＞Mw ＞M η＞Mn 2．高聚物的分子量分布高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。

例如，当我们知道高聚物试样中分于量为M1、M2、M3、…、Mi各组分在总重量中所占的重量分数分别为W1 、W2、W3 、…、Wi 时，我们就可以用对应的W和M作图，得到分子量分布曲线。

第七章凝胶层析定义：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组份得以分离的层析（色谱）方法，又叫扩散层析，排阻层析，分子筛层析第一节基本原理一.分离原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。

一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

凝胶层析分离的基本原理如下：凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。

第——部分是全排阻分子，也可称之为上限分子，是不能起筛分作用的大分子。

第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。

第三部分是全渗透分子，称之为下限分子，是不能起筛分作用的小分子。

如图2—27所示。

从图2—27可以看出，A—B之间为该凝胶的有效分离范围．可分离相对分子质量范围是103一105，高于相对分子质量为105的是全排阻分子，低于相对分子质量为105的是全渗透分子。

二.参数的表示方法及其意义1.表示方法(1)柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(totle volume)表示，单位为m1。

(2)外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那—部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积、空隙体积，以Vo(outer volume)表示，单位为ml(3)内水体积是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积，以V i(inner volume)表示，单位为ml。

(4)凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积．也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积，以Vg(gel volume)表示，单位为ml。

PLgel凝胶色谱柱使用指南为了尽可能延长一根凝胶色谱柱的寿命，请在使用前仔细阅读本说明。

本说明仅针对PL公司的PLGel凝胶色谱柱，如果您使用的是其它类型或其它公司的凝胶色谱柱，请注意并不是所有内容均适用。

柱子安装一般使用1/16”不锈钢管来连接柱子，0.010”内径适用于分析柱，0.020”内径适用于制备，连接管线应该尽量短来避免死体积，会造成系统性能下降。

柱连接接头应使用与Parker 兼容的1/16”锥箍和螺母，详见图1，请按照GPC柱的使用方向来连接，螺母应当在手拧紧后用扳手再拧1/4圈就足够了，过分拧紧并不会改善密封，反而会损坏螺纹造成泄漏。

图 1Compatible Connectors在图1中的X＝0.090”，约等于2.28毫米，螺母的最小长度应为0.210”，约为5.33毫米，请不要使用Waters和Rheodyne公司的产品，他们与PL的柱子并不兼容。

图 2在安装柱子时，请不要将扳手放在图2所示X处，应当放在柱未端六角处。

在与其它的柱子相连之前，建议将柱子与泵相连，用少量流动相清洗一下连接管内部和接头。

流速对于传统的7.5毫米内径的GPC柱子，1.0ml/min是一个最优化的流速，当柱子的内径增加或减少时，应当适当调整体积流速来保证等效的线速度。

表1给了大家一个推荐的流速，然而对于一些高粘度的流动相，应当适当减小或升高温度，如果要更换溶剂，流速要逐渐升高，无论如何，都不要在超过柱子的最大压力下使用柱子（详见表3）。

表 1柱型 适用流速 (ml/min) 建议流速 (ml/min)PLgel 7.5mm ID PLgel MiniMIX 4.6mm ID PLgel Prep 25mm ID 0.5 – 1.50.2 – 0.55.0 – 20.01.00.310.0样品制备及进样根据样品的分子量来优化样品浓度毫无疑问是最好的方式。

宽分布样品通常可以比窄分布样品使用更大的浓度。

葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。

(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。

柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。

然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。

同时大开下口慢速流出蒸馏水。

装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。

否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。

(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。

然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。

本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。

洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。

据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。

但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。

(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。

若使用数次，就需要再生处理。

用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。

若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

授课章节名称凝胶色谱技术授课形式讲授教学目的与要求1.知识内容及要求了解色谱技术分类与各类色谱技术；熟悉凝胶色谱的基本原理和方法。

2.技能内容及要求能独立完成凝胶色谱纯化的具体操作；能掌握凝胶色谱设备的操作流程。

教学重点、难点重点：凝胶色谱；色谱分离中凝胶的分类；柱色谱凝胶的选择；凝胶柱色谱的操作难点：凝胶柱色谱的操作教学方法讲授法、发现法、提问讨论法；多媒体辅助教学。

教学内容1凝胶色谱2色谱分离中凝胶的分类3柱色谱凝胶的选择4凝胶柱色谱的操作凝胶层析常被称为凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography, GFC），有时也叫凝胶渗透色谱（Gel penetration chromatography, GPC），是利用凝胶粒子为固定相并具有网状结构，根据样品的分子大小进行分离的一种层析方法。

是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后，较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，较早的流出层析柱。

较小的分子可以通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部。

这种颗粒内部扩散的结果，使小分子向柱下方移动速度最慢，中等分子次之，样品根据分子大小的不同依次顺序从层析柱内流出而达到分离的目的。

凝胶介质像分子筛一样，将大小不同的分子进行分离，因而又叫体积排阻色谱（Size excluding chromatography, SEC）。

图1 凝胶层析法的原理1 分子大小不同混合物上柱；2 洗脱开始：3 小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于颗粒之外；4 尺寸不同的大小分子分开；5 大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中一、色谱分离中凝胶的分类1交联葡聚糖凝胶葡聚糖商品凝胶牌号为：Sephadex。

它是以环氧氯丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。

交联程度决定凝胶孔结构，依据孔径不同形成G型凝胶的系列产品。

G后面的数字越大表示孔径越大，排阻极限也越大。

粗颗粒（Coarse）流速较快，细颗粒（Fine）流速较慢。

凝胶过滤色谱柱色谱柱操作规程凝胶过滤色谱柱用于体积排阻层析体积排阻，也叫凝胶过滤,依据物质尺寸大小的不同分别。

假如分子的尺寸大于树脂的最大孔径，这种分子就不能进入树脂颗粒内部，它所经过的有效体积最小，最早从洗脱液中流出。

凝胶过滤色谱柱用于体积排阻层析体积排阻，也叫凝胶过滤,依据物质尺寸大小的不同分别。

假如分子的尺寸大于树脂的最大孔径，这种分子就不能进入树脂颗粒内部，它所经过的有效体积最小，最早从洗脱液中流出。

而小分子能够进入树脂的孔道中，经过的有效体积比较大，从洗脱液中流出较晚，分子量越小，流出越晚。

体积排阻层析可以用于纯化的第一步，按分子量大小将产品粗分；也可以用作纯化的中心步骤来改换缓冲液或脱盐，或用于纯化的最后一步来去除杂质，精制产品。

体积排阻层析树脂有预先设定的排阻极限，排阻极限由树脂本身的最大孔径和孔径分布范围决议。

MKF有机凝胶型大孔填料规格有：7—10μm超细颗粒，具有很高的辨别率；20μm，40μm中等颗粒，用于制备型的纯化步骤；60—80μm较粗颗粒，用于经济型制备的纯化步骤；100—150μm粗颗粒，用于产物的大规模捕获。

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当色谱柱使用一段时间以后，柱内由于各种原因，滞留了一些高沸点组分或氧化物等，除柱效有所下降外，还可能显现基线波动或“鬼峰”。

为了去除污染物，使柱效和基线恢复到原来的状态，称为色谱柱的再生。

色谱柱的再生和柱老化有确定区分和不同，它是柱在使用一段时间柱性能下降，经处理后尽量恢复到原来性能的过程。

A、色谱柱在以下几种情况必需再生处理a.使一段时间，柱效明显下降；b.柱被污染，特别是在程序升温时，基线漂移和噪声超过容忍程度或显现“鬼峰”；c.柱头塌陷，柱床短路或断位（在玻璃柱中简单发觉），而显现尖峰或双重峰；d.峰形展宽，保留时间明显变化；e.待分别组分和固定相表面非特异性相互作用，引起保留时间较短的峰拖尾或显现双峰；B、毛细管柱再生的几种方法a.用载气将色谱柱污染物冲洗出来；b.将柱头截去100mm 或更长一些；c.若使用交联的色谱柱，可在仪器上反复注射溶剂进行冲洗。

凝胶渗透色谱在聚合物研究中的应用一、目的要求1. 掌握凝胶渗透色谱（GPC，gel permeation chromatography）的工作原理并了解其构造。

2. 掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。

3. 利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。

二、原理及仪器构造1.凝胶渗透色谱的工作原理。

GPC是一种特殊的液相色谱，所用仪器与高效液相色谱仪类似，但是其色谱柱中的填充相与液相色谱不同，其填充相是具有不同比表面积，孔径分布和孔容的凝胶填料（如葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯凝胶、琼脂糖凝胶等）。

GPC的分离过程是基于分子筛效应而进行的。

聚合物中分子量小的分子在溶液中的流体力学体积较小因而能够在凝胶颗粒内的孔隙中自由地扩散，但随着分子量的增加其在溶液中的流体力学体积也逐渐增大，当增大到与凝胶中孔隙的尺寸大小相当时，便不能顺利进入到凝胶的内部，分子量更大时便完全不能扩散到凝胶颗粒的内部。

如图1所示：根据这一分子筛效应，可以按照分子尺寸大小的差别来进行分离，而有机聚合物的分子尺寸大小又与分子量成图1正相关，也就是说根据这一效应可以将聚合物分子按照分子量大小的差别来进行分离。

当一个聚合物样品被注入色谱柱时，试样溶液流经凝胶固定相颗粒，其中分子尺寸较大的不能进入凝胶孔隙，既被固定相排斥。

因此这些分子便直接流出色谱柱，而他们的色谱峰便最先在色谱图上出现。

另外，样品中尺寸最小的分子则能够进入固定相中所有的孔隙并浸入到整个颗粒内部，于是它们通过色谱柱最慢，保留时间最长，其色谱峰在谱图上出现最晚，而中等尺寸的分子只能够进入固定相中部分较大的孔隙，因而以中等流速流过色谱柱。

这样便按照分子尺寸的大小，按从大到小的顺序实现了样品中各组分的分离。

如图2所示：图2GPC 的实验方法是先利用同一组分已知分子量的窄分散性（w M /n M ≤1.1）聚合物标准试样，在与未知试样相同的条件下得到一系列GPC 谱图。