生物化学与分子生物学实验课讲义

1 实验一 SDS碱裂解法小量制备质粒 一、实验目的 1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。 2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。

二、实验原理 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体，采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。同时整个溶液的pH为12-12.5，使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用RNA酶A处理除去RNA，用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。

三、材料、试剂和仪器 1．试剂 GT116（含psiRNA质粒）菌种 LB液体培养基 溶液 I、溶液 II、溶液 III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录） 2．仪器和材料 超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器

四、实验操作步骤 1． 在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37℃培养15-18个小时。 2． 向1 个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。不要把菌液溅出造成污染。 3． 10000 rpm离心2分钟。注意离心机上放置的管重力要平衡，保护离心机。 4． 弃上清液于废液瓶中。 5． 重复离心一次，尽量弃去上清。 6． 加入100ul冰冷的溶液I，然后剧烈振荡混匀，置冰上。 7． 加入200ul溶液II，轻柔混匀，置冰上4分钟。 8． 加入150ul冰冷的溶液III，轻柔混匀，置冰上5分钟。 9． 12000 rpm离心5分钟。把上清液转移到另一1.5ml离心管中（约450ul）。 10． 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液，剧烈振荡，12000 rpm离 2

心2分钟，小心的收取上层溶液（约450ul）于另一1.5ml离心管中。 11． 加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约400ul）于另一1.5ml离心管中。 12． 2倍体积（800ul）－20℃预冷的无水乙醇，置冰上10分钟，沉淀质粒DNA。 13． 12000 rpm离心5分钟，弃上清 14． 用1ml 冰预冷的70％的乙醇洗沉淀，轻轻转动离心管， 15． 12000rpm离心1分钟，弃上清液。 16． 室温干燥沉淀。加入50ul TE（含20ug/ml RNA酶A）溶解质粒， -20℃保存。

五、质粒相关知识 质粒是细胞染色外一种双链环状DNA分子，它随寄主细胞稳定遗传。对于质粒的研究始于1946年，美国科学家Lederberg.J.首先研究了细菌的性因子（F因子），随后科学家们又相继发现了细菌的抗药性因子（R因子），大肠杆菌素因子（CoE）等，并对这些染色体外遗传单位的性质、功能及与宿主的关系进行了的深入的研究，为建立第一批重组DNA载体提供了科学的材料。 质粒DNA在细菌中的复制分为严紧型（stringent control）和松弛型（relaxed control）。严紧型质粒的复制要在蛋白合成时和DNA聚合酶的III存在，只随染色体的复制而复制，其拷贝数少，每个细胞中只有1-10个；松弛型质粒的复制需要使用的是DNA聚合酶Ⅰ，它在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10-200以上个拷贝。为了便于基因克隆，作为载体的质粒特点如下： 1． 是一个复制子，能自我复制。使它携带的目的基因得到大量扩增。 2． 分子量小（相对分子质量一般在106-107），拷贝数要高，便于应用（如便于提取、基因克隆、酶切鉴定、细胞转化、原位杂交等）。 3． 至少要有两个便于选择的遗传标记，其一用于检查外源DNA是否插入到质粒中，例如载体中引入的LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个146个氨基酸的α-肽，可以被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导合成，新合成的肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，该酶能够水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使含X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。若有外源DNA插入LacZ中，因不能合成正确的α-肽，转化或转染的Lac缺陷菌株，用X-gal筛选，含阳性无隆载体的菌落为白色，含空载体的菌落为蓝色；其二用于选择已把载体转化到细菌中的菌落，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr），只有已转化含有质粒的重组菌在Amp培养基中才能生长。 4． 有多个单一的酶切位点，起点在某个遗传标记上，便于基因克隆，鉴定。 提取的质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的DNA中一个螺旋由10个碱基形成，若一个螺旋大于或小于19个碱基时，分子内就产生一种力量，外于不稳定状态，当分子上有一个缺刻时，分子会立即松驰，形成开环分子。一般超螺旋型质粒应占到总量70％。否则反思你的每步操作是否正确。

六、思考题 1． 分离纯化核酸（质粒DNA）应遵循那些原则（或注意那些事项）？ 2． 溶液I、溶液II、溶液III、酚、氯仿、无水乙醇、等主要试剂各有何作用？ 3

实验二 分光光度法测定DNA的浓度和纯度 一 实验目的 1. 掌握分光光度法估算样品中DNA的浓度和纯度。 2. 熟悉紫外分光光度计的使用方法。

二 实验原理 DNA和RNA吸收光谱的最大值位于260nm，因此可以通过测定OD260来计算样品中DNA和RNA的浓度，一个OD值相当于约50μg/ml的双链DNA、40μg/ml的单链DNA和RNA以及33μg/ml的单链寡核苷酸。利用260nm和280nm两处读数的比值（OD260:OD280）可以估算核酸的纯度。 三 材料、试剂和仪器 1． 仪器：美谱达UV-3100紫外分光光度计 2． 试剂：待测质粒DNA溶液

四、实验步骤 1．打开外部电源主机电源。 2．仪器自检 当打开仪器电源时，仪器便进入自检程序，预热15分钟，自检各项都“OK”后，进入选择工作方式界面。 3. 选择菜单第五项“DNA/蛋白质测量” 4. 按F2键选择测量方法。“吸光度差1”模式或“吸光度差2”模式被选定后，再选择是否“测量背景”。“吸光度差1”模式测量波长为260nm和280nm，背景波长320nm；“吸光度差2”模式的测量波长为260nm和230nm，背景波长为320nm。 3．光度测量未知DNA、RNA浓度的测定： （1）选择“吸光度差1”模式 （3）校零 在样品池中放入参比溶液（1×TE），按【0Abs/100％T】键，仪器进行自动校零，校完后取出参比溶液。 （4）测量 将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入样品池内，按START 即可测量样品吸光度值。 若有多个样品要测试，只需再按TART 即可。 注意：仅在吸光度为0～1之间时，吸光度值和DNA浓度才有良好的线性关系。小量制备的质粒DNA浓度一般约为几ug/ul，因此需要稀释约100倍进行测量。如果浓度仍超过测量范围，需要继续稀释。 每次至少需向微量比色皿中注入400ul溶液才可准确测量。 4. 结果计算 （1）依据下式计算DNA的浓度： A260×50×稀释倍数＝样品浓度（ug/ml） （2）计算比值： A260/A280= DNA的吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的吸收高峰为280nm。纯DNA 4

A260/A280为1.8，纯RNA A260/A280为2.0。A260/A280小于1.8，则表明样品中混有较多的蛋白质。若A260/A280接近2.0，则表明样品中含有较多RNA。

实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳分析 一．实验目的 1．学习掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。

二．实验原理 由于DNA结构的重复性，核苷酸数相同的DNA几乎具有等量的净电荷，所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异，而真正决定DNA分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素取决于DNA分子的大小、构象、构型。采用适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使大小、构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，以达到分离的目的。 三．材料、试剂和仪器 1． 质粒DNA、细菌基因组DNA 2． 琼脂糖、6×Loading Buffer、DNA分子量marker、溴化乙啶（EB） 3. 仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、紫外透射仪、数码相机

四．实验步骤 1． 凝胶的制备 （1） 配0.7%的胶：称取0.21g的琼脂糖，置于三角瓶中，加入1×TAE 30ml，盖上铝箔纸，放在微波炉中化胶，注意用中低火（约1～2分钟），避免沸腾和溢出。 （2） 轻旋转三角瓶把胶混匀，使胶的温度冷却至50℃—60℃。 （3） 正确安装制胶模及梳子。 （4） 将琼脂糖溶液倒入胶模中，并防止梳子的齿下或齿间及凝胶中产生气泡。 （5） 室温静置约30分钟，使胶能完全凝固。轻轻拔出梳子，把胶放入调好水平、装有适量缓冲液的电泳槽内，待用。

2． 电泳 （6） 在透明胶带纸上分滴6×的上样缓冲液1微升/滴，然后于5微升DNA液混匀，加入到上样孔上（用微量移液器的tip头插入1mm深处，轻轻推进样品，可以看见样品下沉）。