生物化学实验讲义
化学工程与技术学院
基础部
实验一酪蛋白的制备
一、目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理．
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、器材
1 、离心机2、．抽滤装置
3、精密pH试纸或酸度计
4、电炉
5、烧杯
6、温度计．
四、试剂与材料
1、牛奶2500mL
2、95％乙醇1200mL
3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL
5、．乙醇—乙醚混合液2000mL
五、操作
1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入
预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)，
弃去上清液。
3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬
浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。
5、准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率：
测得含量
100
%
理论含量
思考题
1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
实验二小麦萌发前
后淀粉酶活力的比较
一、目的
1.学习分光光度计的原理和使用方法。
2.学习测定淀粉酶活力的方法。
3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
二、原理
种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。
2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11
麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
OH COOH NO 2O 2N OH
COOH
O 2N NH 2
3,5 —二硝基水杨酸还原反应（棕色）
休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶
活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。
本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。
三、器材
1.25mL 刻度试管
2. 吸管
3.离心管
4.乳钵
5.分光光度计
6.恒温水浴
7.离心机
四、试剂和材料
1、小麦种子
2、o.1％标准麦芽糖溶液
精确称量100mg 麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
3.pH6.9，0.02mol/L 磷酸缓冲液
0.2mol/L 磷酸二氢钾67.5mL 与0.2mol/L 磷
酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。
4、1％淀粉溶液
1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。
5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂
将1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml 2M L-1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。6、1％氯化钠溶液
五、实验操作
1、种子发芽小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。
2、酶液提取取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心（1500r/min）6—7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。
取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上）。3、酶活力测定
（1）取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟）
将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL。（2）取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温，加水稀释至25mL。并混匀。在A500nm处测定各管的吸光度。填入表中
4、计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，标准标准酶酶A C A C ⨯=
本实验规定：25℃时3min 内水解淀粉释放1mg 麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（u ）。酶活力计算公式为：酶酶酶酶活力n V C ⨯⨯=
式中：C 酶 酶液麦芽糖的浓度，V 酶 提取酶液的总体积，n 酶酶液稀释倍数。
思考题
1、 为什么此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？
而测酶的活力时要在25预保温？反应后又放入沸水浴中？
2、
实验结果说明什么？
实验三 纸层析法分离鉴定氨基酸
一、目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R f 值(比移)来表示的： …
R f ==原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距
层析点原点
