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昆虫总RNA提取

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提取方法：SDS蛋白酶K法
提取试剂：A液：Tris 0.05mol/L；NaCl 0.1mol/L；EDTA 0.1mol/L；Ph=7.0~8.0.
B液：5%SDS
C液：20mg/ml 蛋白酶K
RNase 10mg/ml、Tris饱和酚（pH=8.0）、氯仿/异戊醇（24：1）
提取步骤：
（1） 提取DNA前，先用70%的乙醇和无菌水先清洗虫体三遍，以去除虫体表面可能附
着的杂质。
（2） 取昆虫组织加入1.5ml离心管中，加入100µlA液用研磨棒研磨至基本透亮，再加
入380µlA液冲洗研磨棒，然后加入B液60µl、C液6µl。58℃金属浴3~4小时。
（3） 加入RNase至终浓度100µg/ml，充分混匀后60℃金属浴30min。
（4） 反应液冷却至室温，加入等体积的饱和酚，温和地上下转动混匀，反复该动作10min，
切勿剧烈震荡。温室5000g离心15min。取上清至一干净的离心管中。重复该步直至水相与
液相交界处看不到白色的蛋白质为止，取上清。
（5） 上清中加入等体积的氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒10次，室温8000g离心10min，
取上清。
（6） 上清中加入两倍体积的预冷无水乙醇，-20℃冰箱内放置10min，沉淀DNA，12000g
离心10min，弃上清。
（7） 在留有沉淀的离心管中加入1ml 70%的预冷无水乙醇洗涤DNA，12000g离心5min，
弃上清。
（8） 管口向下，在室温自然干燥DNA，向干燥的DNA中加入适量TE（30~50µl）溶解，
4℃保存。
DNA的检测
纯度及浓度检测：使用微量分光光度计（NanoDrop2000/2000c）对所提取DNA进行检测，
若OD260/OD280的值在1.7~1.9之间(>1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污
染)。用于PCR扩增的DNA浓度应在100ng/µl左右。
完整性检测：取2~5µl样品与载样缓冲液（Loading Buffer）2µl混合，点样于1.0%的琼脂糖
凝胶,然后置于1×TAE缓冲液中电泳，电泳电压为110V，时间约30min。用凝胶成像系统检
测基因条带的有无，若出现明显条带则说明完整性良好。
昆虫总RNA提取：
（所有操作都在无菌操作台内进行，实验样品在冰盒上保存，4℃低温离心，操作人员带好
口罩和胶皮手套防止污染）
1. 将昆虫冷冻或新鲜组织在1.5ml离心管中加入500μl的Trizol快速研磨均匀（研磨时间
不宜超过2min），活体昆虫研磨前要清洗，去除表皮杂质。研磨完用500μlTrizol冲洗研
磨棒。静置5min，使得核蛋白与核酸完全分离。10000rpm4℃离心10min取上清。
2. 加入200μl的氯仿，剧烈振荡15sec，冰上放置5min，每1min上下混匀一次，10000rpm4℃
离心10min，取上清。
3. 取上清液转移至干净的离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃放置20min，
沉淀RNA。
4. 10000rpm4℃离心10min，弃上清。
5. 加入1ml75%的乙醇洗涤沉淀。10000rpm4℃离心5min，弃上清。冰上干燥5min。
6. 加入30-50μl的RNase-free ddHKO,充分溶解RNA。将所得的RNA溶液置于-70℃保存或
用于后续实验。

总RNA质量检测
RNA纯品OD260/OD280 1.7-2.0 低（蛋白质或酚污染） 高RNA有降解
OD260/OD230 大于2.0 低表明有小分子盐污染
稀释到浓度500-1000ng/μl
电泳

RNA 反转cDNA
（RNA性质不稳定提出的RNA最好在第一时间进行反转形成cDNA以便进行后续实验）
1. 基因组DNA消除
2 5 X gDNA Eraser Buffer 2.0μl
1 gDNA Eraser 1.0μl
total RNA 1.0μl
6 RNase Free dH2O 6 .0μl
10μl

42℃ 2min
Store at 4℃
2. 反转录反应
4 5 X PrimeScript Buffer 2(for real time) 4.0μl
3 PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1.0μl
5 RT Primer Mix 1.0μl
6 RNase Free dH2O 4.0μl
20μl
反应时间
37℃ 15min
85℃ 5sec
Store at 4℃

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总RNA的提取和RT-PCR最新详解

总RNA的提取和RT-PCR最新详解


操作步骤
5. 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5 min。 6. 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉
淀。 7. 加入1 ml 75%乙醇，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。 8. 4℃ 12,000g离心5 min，尽量弃上清。 9. 室温晾干或真空干燥5 min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很
原理
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在 上层水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间 层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
关键点
所有RNA的提取过程中都有五个关键点： 1. 样品细胞或组织的有效破碎； 2. 有效地使核蛋白复合体变性； 3. 对内源RNA酶的有效抑制； 4. 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 5. 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
RNA酶污染来源
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌 等。
严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于 操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器 械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各 种试剂的污染。
最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的RNA酶。
实验材料：HEK293人胚肾细胞
操作步骤
1. 细胞中加入1 ml Trizol（RNAisoPlus）用移液枪反复吹吸直无明显沉 淀后，室温放置5min，使其充分裂解。 （注意：此时可放入-70℃长期保持。 ）
2. 按200 ul 氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3 min。 (注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和Trizol不分层。)
总RNA的提取及相关实验方法

总RNA的提取及相关实验方法

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。

若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。

在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。

TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。

TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。

Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。

总rna提取实验报告

总rna提取实验报告

总rna提取实验报告总RNA提取实验报告一、引言RNA是一种重要的核酸分子，它在细胞中起着传递和转录遗传信息的重要作用。

总RNA提取是分子生物学研究中常用的实验技术，它能够从细胞中提取出所有的RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA等。

本实验旨在通过总RNA提取技术，获取细胞中的RNA样品，为后续的RNA分析提供基础。

二、材料与方法1. 实验材料：- 细胞样品：本实验使用细胞系A作为研究对象。

- 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解酶和蛋白酶抑制剂等。

- 乙酰酸酚/氯仿溶液：用于提取总RNA。

- 无水乙醇：用于沉淀RNA。

- TE缓冲液：用于溶解RNA沉淀物。

- RNase-free水：用于制备实验液。

2. 实验步骤：（1）细胞采集与裂解：将培养好的细胞收集到离心管中，加入适量的细胞裂解缓冲液，轻轻摇晃使细胞均匀裂解。

（2）总RNA提取：将细胞裂解液与乙酸酚/氯仿溶液按比例混合，离心分离上清液和有机相，收集上清液。

（3）沉淀RNA：向上清液中加入等体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀，沉淀RNA。

（4）洗涤：用70%乙醇洗涤RNA沉淀物，去除杂质。

（5）溶解：用RNase-free水溶解RNA沉淀物，得到总RNA样品。

三、结果与讨论通过上述实验步骤，成功地从细胞系A中提取到了总RNA样品。

提取后的总RNA样品呈现出明亮的透明溶液，没有明显的沉淀或杂质。

为了验证提取的总RNA质量和纯度，我们使用了紫外吸收光谱法进行测定。

根据测定结果，我们发现总RNA样品的吸光度比例A260/A280为1.8，符合理想的RNA纯度范围（1.8-2.0）。

这表明我们所提取的总RNA样品中没有明显的蛋白质、核酸污染。

同时，我们还进行了琼脂糖凝胶电泳分析，观察到总RNA 样品在琼脂糖凝胶上呈现出清晰的17S和28S两个带状条带，证明我们提取的总RNA完整且无降解。

总RNA提取实验是RNA研究的基础，成功地提取到高质量的总RNA样品对后续的实验具有重要意义。

RNA 提取与检测

RNA 提取与检测


RNA提取注意事项

在提取液中加入巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助
在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙 醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时， 用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温 下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外 核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要 比高浓度的更易降解 。 在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以 增加抽提次数。
5、 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
DEPC(二乙基焦碳酸酯)

DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组 氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心 试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度, 然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残 存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活 性。 但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能 用DEPC处理，但可以用DEPC处理过的水来配制。 。




玻璃器皿处理： 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200℃烘烤2小时以上。 塑料器皿处理： 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏 水冲净。。 试剂处理： 实验用的所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至终 浓度0.1%，然后剧烈震荡混匀10分钟，然后高压灭菌以 消除残余的DEPC。 专用的RNA操作室、专用器械。 操作时戴口罩、帽子、手套 一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的 内部和外部，基本达到要求。 注意：DEPC与氨水混合后会产生致癌物，须小心在通 风柜中使用。