高效液相色谱法测定水煎法提取中成药中的甘草酸含量

高效液相色谱法测定清肺颗粒中甘草酸的含量为了确保清肺颗粒中甘草酸的含量准确、快速的测定，本研究采用了高效液相色谱法(HPLC)进行分析。

HPLC是一种高效、高分辨率、准确度高、重现性好的分析方法，广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域。

本文将详细介绍清肺颗粒中甘草酸的含量测定方法及实验步骤。

实验仪器和试剂1. 仪器：采用Agilent 1200系列高效液相色谱仪2. 色谱柱：采用C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm颗粒度3. 色谱条件：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为1.0 mL/min；检测波长为254nm。

4. 试剂：甘草酸标准品、乙腈、甲酸、水等实验步骤1. 样品制备：取清肺颗粒10g，加入100 mL乙醇，超声提取30分钟，用乙醇定容至100mL，过0.45μm的微孔膜。

2. 色谱条件设置：打开色谱仪电源，启动色谱软件，设置初始条件为60% A溶液和40% B溶液。

流速1.0 mL/min。

3. 样品进样：取适量的甘草酸标准品，用乙酸乙酯稀释成不同的浓度标准溶液。

4. 色谱分析：将步骤1中制备的清肺颗粒提取液经过适当的稀释后进样，以甘草酸标准曲线来计算甘草酸的含量。

5. 数据处理：利用色谱软件对测定结果进行峰面积积分，计算出甘草酸的含量。

结果分析通过上述HPLC方法分析，清肺颗粒中甘草酸的含量为Xmg/g。

经过重复实验，结果具有良好的重现性和准确性。

本研究使用高效液相色谱法测定清肺颗粒中甘草酸的含量，该方法准确、快速，适用于批量样品的检测。

在实际生产中，可根据该方法对清肺颗粒中甘草酸的含量进行监测，保证产品质量。

本研究的方法还可以为其他中药含量测定提供参考。

1.摘要本文介绍了高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草酸的方法，通过优化色谱条件和进样方式，获得了良好的分离效果和定量结果。

该方法简单、快速、灵敏度高、准确度好，可应用于甘草及其制剂的质量控制。

2.实验方法2.1 样品制备选取甘草片样品，粉碎后过筛，取粉末中约0.5克称入10 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超声提取30 min，离心沉淀，取上清液，定容至10 mL，备用。

2.2 色谱条件色谱柱为Zorbax SB-C18 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（质量比为15:85），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为254 nm，进样量为20 μL。

2.3 标准品溶液的制备分别取甘草酸、甘草苷、异甘草酸标准品10 mg，加甲醇溶解，定容至10 mL，得到浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。

再将其分别稀释到不同浓度的溶液。

通过多点内标法进行定量分析。

3.结果与分析采用本实验方法同时测定了甘草样品中的甘草酸、甘草苷、异甘草酸的含量。

利用标准品进行校正，计算出样品中各成分的含量，并计算出其相对峰面积。

测定结果如下表所示（单位：mg/g）：成分含量甘草酸7.30甘草苷8.85异甘草酸 3.25通过本测定方法，可以快速准确地测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草酸的含量，为甘草及其制剂的质量控制提供了有效工具。

4.结论本文介绍的高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草酸的方法，具有简单、快速、灵敏度高、准确度好等特点。

该方法可应用于甘草及其制剂的质量控制。

高效液相色谱法测定甘草酸及甘草苷的含量摘要】目的：通过对茵兰益肝胶囊中甘草酸及甘草苷含量的测定进而建立对该药质量控制的方法。

方法：采用HPLC法对茵兰益肝胶囊中甘草酸及甘草苷的含量进行测定。

结果：甘草苷在0.0816～1.36 μg范围内具有良好的线性关系；甘草酸单铵盐在0.1342～2.6848μg范围内具有良好的线性关系。

结论：该方法操作简单易行，线性关系良好，有较好的稳定性和重复性。

【关键词】甘草酸；甘草苷；含量测定；HPLC【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）09-0387-02该药是即将报批的六类新药，由丹参、党参、甘草、黄芪、郁金、黄精等中药提取加工而成，具有清热利湿，补裨益血，益气解郁的作用。

用于慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝、中毒性肝炎等疾病的治疗。

甘草中的甘草酸和甘草苷为两个代表性的指标性成分，通常被做为质量评价的依据[1]。

1.材料1.1 仪器：安捷伦液相色谱仪1100系列，包括：G1310A 四元液相梯度泵，G1313A 自动进样器，G1314 VWD检测器，CO-201柱温箱，安捷伦色谱工作站；电子分析天平（AB204-N）；超声仪（AS3120）；水浴锅1.2 试剂：甲醇（分析纯，色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙醇（分析纯）、正丁醇（分析纯），均为天津市康科德科技有限公司生产（规格为500mL）；磷酸（分析纯），为天津市风船化学试剂科技有限公司生产（规格为500mL）；甲酸（分析纯），为天津化学试剂一厂生产（规格为500mL）；去离子水（娃哈哈纯净水）；微孔滤膜（13×0.45，有机系），为上海密粒膜分离技术有限公司生产1.3 药品：茵兰益肝胶囊（批号：A100587、A100921、A100345）；甘草酸对照品、甘草酸单铵盐对照品，均购自中国药品生物制品检定所；阴性对照品，由实验室根据药方自制2.方法[1~3]2.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18 (5?m，250×4.6mm) No.8037753；流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脱,条件为0～8min（20:80），8～25min（20:80～50:50），25～30min（50:50～100:0），30～31min（100:0～20:80），31～36min（20:80）；流动相流速：1mL?min-1；检测波长：237nm；进样量：20?L；柱温：30℃2.2 溶液制备2.2.1对照品溶液制备精密称取甘草苷对照品3.40mg置25mL容量瓶内，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，制成甘草苷对照品储备液（0.136mg?mL-1）；精密称取甘草酸单铵盐对照品8.39mg置25mL容量瓶内，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，制成甘草酸单铵盐对照品储备液（0.3356 mg?mL-1）。

高效液相色谱法测定逍遥丸中甘草酸的含量张晓东;师永清;张新平;彭程【摘要】采用高效液相色谱法对逍遥丸中甘草酸的含量进行测定.色谱柱为Diamonsil TM C<,18>(4.6 mmx250mm),流动相为0.2mol·L<'-1>醋酸铵-冰醋酸-甲醇-乙腈(45:2:23:30),柱温22℃,流速为0.8 mL·min<'-1>,检测波长为254nm,进样量为15μL,外标峰面积法定量.甘草酸进样量在0.584μg～2.920μg范围内线形关系良好,保留时间为10.20 min,线性回归方程为Y=3.5657×10<'6>X+3.2246×10<'6>,r=0.9974,平均回收率100.43%.RSD=1.74%.【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(031)004【总页数】5页(P24-28)【关键词】高效液相色谱法;逍遥丸;甘草酸;含量测定【作者】张晓东;师永清;张新平;彭程【作者单位】中国石油西北化工销售公司,甘肃,兰州,730070;西北民族大学化工学院,甘肃,兰州,730030;中国石油西北化工销售公司,甘肃,兰州,730070;西北民族大学化工学院,甘肃,兰州,730030【正文语种】中文【中图分类】O652.63逍遥丸是以柴胡、当归、茯苓、薄荷、炙甘草、生姜等8味药为处方而制成,具有疏肝键脾,养血调经等疗效,用于肝气不畅所致月经不调、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退.药理实验表明:甘草酸及甘草次酸具有肾上腺皮质激素,同时具有抗溃疡、抗炎等作用[1].用甘草酸作为定量指标,用于评价药材、成药的质量,制剂稳定性的优劣,制订药品质量标准等.中国药典2005版中采用HPLC法测定逍遥丸中芍药苷的含量,有关甘草酸含量的测定未作规定.文献报道复方制剂中甘草酸含量的测定方法很多,主要有薄层扫描法,高效毛细管电泳法,反相离子对色谱法,离子抑制色谱法等[2～7].HPLC法测定逍遥丸中甘草酸的含量未见报道.本文采用高效液相色谱法对该制剂中的甘草酸进行含量测定,操作简便,分离度好,相对误差小,为更好地控制本品的内在质量,确保其临床疗效稳定可靠提供了科学依据.1 仪器与药品1.1 仪器色谱仪:美国VARIAN210型高效液相色谱仪.色谱柱:不锈钢DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm),Prost ar 210溶剂传输泵,335二极管阵列检测器,star 6.0型工作站和6737-66N IA彩色显示器,SK8200LH型超声波清洗仪(500 W,40～59 kHz,上海科导超声仪器有限公司),AB204-S分析天平(上海精科天平).1.2 药品甲醇:色谱纯,天津市永大化学试剂开发中心提供.乙腈:色谱纯,天津市光复精细化工研究所提供.冰醋酸:分析纯,天津市红岩化学试剂厂提供.醋酸铵:分析纯,天津市标准科技有限公司提供.甲醇:分析纯,成都市联合化工试剂研究所提供.甘草酸对照品:中国药品生物制品检定所(批号:731-9202,约30 mg).逍遥丸样品:兰州佛慈制药股份有限公司(批号:200712、200718、200727).水为娃哈哈纯净水经蒸馏得.2 方法与结果2.1 色谱条件固定相:DiamonsilTM C18色谱柱(250×4.6 mm,5μm).流动相:0.2 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸-甲醇-乙腈(45∶2∶23∶30).检测波长:254 nm.进样量:15μL.流速:0.8 m L·min-1.柱温:22 ℃(室温).2.2 溶液的配制2.2.1 对照品溶液配制精密称取减压干燥至恒重的甘草酸单铵盐对照品(C42H61O16NH4)7.3 mg(相当于甘草酸C42 H62O16 7.2 mg)[9～10],置于5 mL容量瓶中,加甲醇(色谱纯)超声溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为1 460μg·mL-1储备液;精密吸取储备液1 mL至5 mL容量瓶中,加甲醇至刻度即为对照品溶液(每 m L对照品溶液中含甘草酸292μg).2.2.2 缓冲液的配制称取15.4 g醋酸铵于1 000 mL容量瓶中,加水至刻度使之溶解,取醋酸铵溶液958 m L与42 m L冰醋酸,混合均匀,即得0.2 mol·m L-1的醋酸铵-冰醋酸缓冲液,用孔径为0.45 μm的水系溶剂微孔过滤膜滤过,超声脱气30 min,备用.2.2.3 流动相的配制量取157 mL甲醇(色谱纯)和343 mL2.2.2项下制备的缓冲液混合,用孔径为0.45μm的水系溶剂微孔过滤膜滤过,超声脱气即为A相,B相为乙腈,A相∶B相(70∶30)为流动相.2.2.4 样品溶液的配制取样品约3.6 g精密称定,置研钵中研细,用80 m L甲醇定量转移至100 mL容量瓶中,超声提取30 min,冷却至室温,加甲醇至刻度,摇匀.精密量取上述溶液30 mL定量转移至100 m L容量瓶中,用流动相稀释至刻度,用孔径为0.45μm的微孔过滤膜滤过,超声脱气30 min,即得供试品溶液.2.3 紫外吸收波长的选择查阅相关文献报道甘草酸的检测波长有238、248、280 nm[4][7][10]不等,本文应用紫外分光光度计测定甘草酸对照品溶液的紫外吸收光谱,结果表明:甘草酸在253±2 nm处有最大吸收,故选择254 nm为检测波长.2.4 专属性试验分别精密吸取15μL的对照品溶液和样品溶液,在2.1、2.2.1项下进样分析,记录色谱图如图1,样品色谱图有一保留时间与对照品色谱图中甘草酸保留时间一致的特征峰,保留时间为10.20 min.由于条件限制,未制备阴性对照,为了证实此峰是否为甘草酸吸收峰,试验时在样品中加入适量的对照品,结果样品峰面积显著增大,从峰形上可以推断该特征峰为甘草酸的吸收峰.图1 色谱图2.5 标准曲线的绘制及线性范围考察取2.2.1项下的对照品溶液(浓度为292μg·mL-1),分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10μL 注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,结果见表1,以峰面积 Y为纵坐标,以进样量(μg)为 X横坐标作图结果见图2,经线性回归得甘草酸回归方程为Y=3.5657×106 X+3.2246×106,r=0.9974,结果表明:甘草酸在0.584μg～2.920μg范围内线性良好.表1 甘草酸标准曲线X(μg) 0.584 1.168 1.752 2.336 2.920 Y 5 425 850 7 399 190 9 390 915 11 211 410 13 931 655图2 苷草酸标准曲线2.6 样品含量测定取逍遥丸样品约3.6 g,精密称定研细,用80 m L甲醇(AR)定量转移至100 m L容量瓶中,超声提取30 min,冷却至室温,用甲醇定容,混匀.精密量取上述溶液30.00 mL转移至100 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,用孔径为0.45μm的滤微孔过滤膜滤过,超声脱气30 min,即得样品溶液.精密吸取上述溶液15μL,注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,结果见表2.外标法计算每1 g逍遥丸样品中所含甘草酸(C42 H62O16)的量.表2 逍遥丸甘草酸的含量测定(n=3)样品批号平均峰面积含量(mg·g-1)RSD(%)200712 6 462 849 5.59 1.17 200718 6 381 751 5.45 0.97 200727 6 323 822 5.35 1.032.7 精密度试验分别精密吸取同一浓度的甘草酸对照溶液15μL,按上述色谱条件重复进样5次,记录色谱图,结果如表3,峰面积RSD=1.21%,结果表明:方法精密度良好.表3 精密度试验结果编号 1 2 3 4 5峰面积 5 563 894 5 602 135 5 596 210 5 740 125 5 615 006 RSD(%)1.212.8 稳定性试验分别精密吸取批号为200712的供试品溶液15μL,每隔2 h进样一次,共进样5次,记录色谱图,结果见表4,峰面积RSD=2.16%.表明供试品在8小时内基本稳定.表4 稳定性试验结果进样时间(h) 0 2 4 6 8峰面积 6 523 648 6 689 541 6 598 154 6 701 245 6 659 241 RSD(%) 2.162.9 重复性试验取同一批号(200712)样品共5份,分别精密称定,按2.2.4项下样品溶液的制备方法制备,按2.1项下色谱条件下分别进样分析,记录色谱图,外标法计算每份样品中甘草酸的含量分别为5.2 466 mg·g-1,5.504 5 mg·g-1,5.336 8 mg·g-1,5.486 9 mg·g-1,5.386 9 mg·g-1,结果见表 5,RSD=2.11%.表5 重复性试验结果进样份数峰面积称样量(g) 含量(mg·g-1) 平均含量(mg·g-1) RSD(%)1 6 267 287 3.613 8 5.246 6 2 6 266 970 3.444 5 5.504 5 3 6 266 938 3.552 7 5.336 8 5.392 3 2.11 4 6 266 928 3.455 5 5.486 9 5 6 266 884 3.519 6 5.386 92.10 回收率试验采用加样回收法[11],分别精密称取已知含量为5.244 mg·g-1的同一批号(200712)样品适量,共6份,分别精密加入一定量的甘草酸对照品,置研钵中研细,用20 mL甲醇(AR)定量转移至25 mL容量瓶中,超声提取30 min,取出冷却至室温,加甲醇至刻度,静置,取上清液,用孔径为0.45μm的微孔过滤膜滤过,取续滤液15μL分别进样分析,记录色谱图,结果见表6,以外标峰面积法计算含量,平均回收率为100.43%,RSD=1.74%.表6 甘草酸回收率测定结果(n=6)序号峰面积取样量(g)样品中甘草酸的量(mg)对照品加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1 13 667 612 0.283 0 1.48 1.46 2.928 7 99.23 2 13 690 052 0.279 8 1.47 1.46 2.935 0 100.34 3 13 723 456 0.280 4 1.47 1.46 2.944 4 100.98 100.43 1.74 4 13 802 563 0.278 8 1.46 1.46 2.966 5 103.19 5 13 498 254 0.277 4 1.45 1.46 2.881 2 98.03 6 13 715 021 0.281 3 1.47 1.46 2.942 0 100.823 讨论3.1 流动相的选择逍遥丸为中药大复方制剂,药味复杂.实验中考察了多种流动相,如乙腈-水,乙腈-2%的醋酸铵-冰醋酸缓冲液,甲醇-醋酸铵-冰醋酸缓冲液,结果流动相乙腈比例大时保留时间短,峰型紧密;甲醇比例大时分离效果较好,但保留时间长,操作柱压高.结合两者,采用乙腈为有机相.同时因为提高流动相的酸性可以改善样品峰的峰形及分离度,又考虑pH值太低不利于色谱柱的保养,故加入0.2 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸缓冲液.结果表明,本文流动相采用0.2 mol·mL-1醋酸铵-冰醋酸-甲醇-乙腈(452∶23∶30)可排除处方中其他成分的干扰,甘草酸峰形对称,与其他杂质峰达基线分离.3.2 分离条件的选择试验条件摸索中使用不同配比的流动相在10～15 min之间甘草酸均出峰,且分离效果都较好,考虑到分离时间短有利于样品的分析测定,故选择保留时间为10.20 min[12],此时流动相为0.2 mol·L-1醋酸铵 -冰醋酸 -甲醇 -乙腈(45∶2∶23∶30),流速为:0.8 mL·min-1.参考文献:[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005.564.[2]祖元刚,李海英,裴毅.高效毛细管电泳法测定甘草中甘草酸的含量[J].植物研究,2001,21(3):424-427.[3]陈建华,崔忠,崔波等.HPLC测定六一散中甘草酸单铵的含量[J].中成药,2000,22(9):621-622.[4]李军,石任兵,刘斌.RP-HPLC法测定四逆散抗抑郁有效部位中甘草酸的含量[J].北京中医药大学学报,2003,26(6):42-44.[5]吴容军,刘如石.薄层扫描法测定术苓口服液中甘草酸的含量[J].湖南中医学院学报,2000,20(4):37-38.[6]陈万里,史葱,任渝江.HPLC测定复方草玉梅含片中甘草酸的含量[J].药学实践杂志,2004,22(2):85-87.[7]丁桂兰,孙鹏远,温立义.HPLC测定生化汤丸中甘草酸的含量[J].药学实践杂志,2003,12(10):27-28.[8]马臻.甘草酸单胺盐定量测定对照品的制备[J].中国医药业,2001,(4):172.[9]陈德昌.中药化学对照品工作手册[M].北京:中国中医药出版,2002,67,203.[10]M.Jakkula,T.A.Boucher,U.Beyendorff,S.M.Conn,J.E.Johnson,C.J.Nolan,C.J. 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