简易胶原酶消化法提取兔原代肝细胞及培养

胶原酶胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。

当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。

胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。

因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。

常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。

胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。

1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。

用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离。

2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。

它能消化多种组织。

3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。

它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。

4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。

胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。

注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。

钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。

3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。

消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。

如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。

肝细胞分离技术的研究进展袁晓华【摘要】肝细胞移植在治疗急性肝衰竭和遗传代谢性肝病等方面有着十分广阔的应用前景.但肝细胞分离技术仍不完善,需进行深入研究和探讨,以提高细胞的活性和数量,保留细胞功能.文章就肝细胞基本的分离方式及主要实验物种的相关分离方法的进展进行综述.%Liver cell transplantation presents clinical benefits in patients with inborn errors of metabolism and acute liver failure as an alternative. However, the success of such a therapeutic approach remains limited by the methods of hepatocyte isolation, which needs intensive study to enhance the yield and viability of hepatocytes, and functional levels. The purpose of this overview is to examine the different hepatocyte isolation methods and to describe some of the currently available techniques used for different species, in view of a potential clinical use.【期刊名称】《中国现代手术学杂志》【年(卷),期】2011(015)001【总页数】4页(P69-72)【关键词】肝细胞移植;细胞分离【作者】袁晓华【作者单位】南华大学,衡阳,421001【正文语种】中文【中图分类】R657.3肝细胞移植(liver cell transplantation, LCT)是目前可用于临床治疗急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)和遗传代谢性肝病的方法之一，也可作为等待原位肝移植(orthotopic liver transplantation, OLT)的过渡治疗[1]。

大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法
刘学忠;李慧敏;王富民;顾建红;刘宗平
【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2009(025)001
【摘要】体外分离培养肝细胞是人工肝、毒理学、药理学、生理学以及基因工程等研究的基础，良好的分离技术是获取高活性肝细胞的前提。

长期以来，国内外普遍采用Seglen[1]的胶原酶原位两步灌流法，该法成为分离肝细胞的经典方法，在此基础上又发展了半原位酶分离技术[2]。

但该类方法仍存在操作繁琐、流程长、胶原酶耗费大等问题。

本研究拟采用胰酶、胶原酶两步消化法获取肝细胞，以求操作简便，胶原酶用量少，并能满足一般实验室对肝细胞的要求。

【总页数】3页(P222-224)
【作者】刘学忠;李慧敏;王富民;顾建红;刘宗平
【作者单位】扬州大学兽医学院,江苏,扬州,225009;扬州大学兽医学院,江苏,扬州,225009;扬州大学兽医学院,江苏,扬州,225009;扬州大学兽医学院,江苏,扬
州,225009;扬州大学兽医学院,江苏,扬州,225009
【正文语种】中文
【中图分类】Q2-33
【相关文献】
1.原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究 [J], 胡聪;韩聚强;修贺明;徐铮;郝晓东
2.大鼠肝细胞的分离及BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的影响 [J], 张娓;张东
铭;张苏河;张钦宪
3.大鼠肝细胞分离、原代培养及生物学特性研究 [J], 徐哲;白雪帆;滕光菊;黄长形
4.高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养 [J], 王新颖;李维勤;李宁;黎介寿
5.改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究 [J], 庄鹏;李志莹;范紫香;江元森;姚集鲁
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简易胶原酶灌流法分离培养大鼠肝细胞朱婧;乔中东;徐建雄;刘立民【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2006(17)3【摘要】目的:对传统的胶原酶灌流法加以改进,以节约分离肝细胞的实验时间和成本.方法:采用离体法,分3次从肝窦灌注含有肝素钠的D-Hanks液共150 mL;用30 mL终浓度为0.04%的胶原酶液(Ⅰ:Ⅳ=1:4)灌洗2 min;去除表皮等结缔组织,过筛、离心洗涤即得肝细胞.结果:平均1 g大鼠肝脏能获取7×106～8×106个肝细胞,细胞存活率为96.3%.结论:简易胶原酶灌流法的胶原酶用量是Seglen二步灌注法用量的1/16,是半原位的1/4;灌流时间约5 min,是Seglen二步灌注法的1/4;半原位法也通常需要6～7 min.此法具有装置简单、试剂消耗量小、操作方便快捷、实验成本低的特点,为需要周期性重复建立大鼠肝细胞模型的实验提供了一种简单快速的分离方法.【总页数】2页(P392-393)【作者】朱婧;乔中东;徐建雄;刘立民【作者单位】上海交通大学,农业与生物学院,上海,200040;上海交通大学,农业与生物学院,上海,200040;上海交通大学,农业与生物学院,上海,200040;上海交通大学,农业与生物学院,上海,200040【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.用原位灌流法分离大鼠肝细胞 [J], 劳全林;江青艳;高淑静;张守全;朱晓彤;傅伟龙2.大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法 [J], 刘学忠;李慧敏;王富民;顾建红;刘宗平3.组织块培养法及胶原酶消化法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞 [J], 魏运军;张学渊4.低浓度胶原酶原位循环灌流法用于原代大鼠肝细胞分离 [J], 姚云清;张定凤;黄爱龙;周卫平;任红;罗云5.改良胶原酶经腹主动脉灌注消化法分离大鼠肝细胞 [J], 余松林;沈柏用;彭承宏;韩宝三;张瑞;杜志勇;吴旭波;吴薇;王加祥;黄芳;李宏为因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

532024.4·试验研究0 引言猪圆环病毒（PCV ）是Circoviridae 科Circovirus 属的一种无囊膜的单链环状DNA 病毒。

在已知的4个血清型中，PCV2为猪易感的致病性病毒[1]。

PCV2感染会诱导宿主免疫抑制引起猪圆环病毒病（PCVD ），包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、新生仔猪先天性脑震颤、皮炎与肾病综合征、猪呼吸道病综合征、母猪繁殖障碍等，给全世界养猪业带来较大的经济损失，是世界各国的兽医与养猪业者公认的造成重大影响的猪传染病[2]。

PCV2的感染在猪生长发育的不同阶段有不同的组织嗜性。

但无论是胎儿阶段还是出生后，肝细胞都是PCV2感染和复制的靶细胞。

因此，PCV2也被视为一种能够诱导猪肝炎的病毒[3]。

且PCV2诱导的肝细胞凋亡在PCV2引发的相关病变和疾病的发病机制中具有关键性作用[4]。

因此，方便、快捷地获取大量有活性的猪肝细胞对于研究PCVD 的致病机制具有重大意义。

目前获取肝细胞常用的方法主要包括机械分离细胞法、非酶分离细胞法、离体酶消化法和酶灌流法等[5]。

因此，本试验采用简便、经济、无需特殊设备、仅需部分肝组织的离体酶消化法，比较不同酶消化分离猪原代肝细胞的效果，为一般实验室提取分离大量有活性的猪肝细胞提供参考。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂新鲜猪肝组织，Hank's 平衡盐溶液（HBSS ），磷酸盐缓冲液（无菌PBS ），4%多聚甲醛（PFA ），收稿日期：2024-01-27基金项目：国家自然科学基金项目：复杂器官与组织在脾脏内的功能性再生（32230056）作者简介：周徐倩（1999-），女，汉族，浙江温州人，硕士在读，研究方向：组织工程与再生医学。

*通信作者简介：董磊（1978-），男，汉族，安徽阜阳人，博士，教授，研究方向：组织工程与再生医学、生物材料。

周徐倩，董磊．不同酶消化法提取猪原代肝细胞的效果比较[J]．现代畜牧科技，2024，107（4）：53-55．　doi ：10.19369/ki.2095-9737.2024.04.014．　ZHOU Xuqian ，DONG Lei ．Comparison of the Effect of Different Enzyme Digestion Methods on Extraction of Porcine Primary Hepatocytes[J]．Modern Animal Husbandry Science & Technology ，2024，107（4）：53-55．不同酶消化法提取猪原代肝细胞的效果比较周徐倩，董磊*（南京大学，江苏 南京 210023）摘要：猪肝细胞是猪圆环病毒的靶细胞，简单快速地提取猪原代肝细胞对于研究猪圆环病毒病的致病机制具有重要意义。

兔关节软骨细胞的原代培养和去分化现象任保;李慧芳;左喜爱;黄殊变;于建红【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2010(027)002【摘要】目的:建立兔关节软骨细胞分离、培养的方法,探讨其传代过程中细胞外基质及其形态的变化.方法:采用胰酶和Ⅱ型胶原酶两步消化法结合机械吹打获得分散的单个兔关节软骨细胞,观察单层培养的不同代数兔关节软骨细胞的细胞形态变化;采用免疫细胞化学方法检测不同代数兔关节软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达.结果:兔关节软骨经两步消化后,可获得高纯度的软骨细胞,经免疫组化及甲苯胺蓝染色呈阳性结果,同时观察到兔关节软骨细胞在传代过程中细胞发生了去分化现象.结论:软骨细胞单层培养通过传代可以获得大量的试验细胞,但仅限于使用三代以内的细胞.【总页数】4页(P8-11)【作者】任保;李慧芳;左喜爱;黄殊变;于建红【作者单位】河北省张家口市第二医院骨科,河北,张家口,075000;河北省张家口市第二医院骨科,河北,张家口,075000;河北省张家口市第二医院骨科,河北,张家口,075000;河北省张家口市第二医院骨科,河北,张家口,075000;河北省张家口市第二医院骨科,河北,张家口,075000【正文语种】中文【中图分类】R-332【相关文献】1.兔关节软骨细胞原代培养及生物学鉴定 [J], 赵海洋;马子君;路屹;陈传好2.兔关节软骨细胞原代培养及生物学鉴定 [J], 赵海洋;马子君;路屹;陈传好3.体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象 [J], 徐磊;叶朝阳;周燕;谭文松;4.体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象* [J], 徐磊;叶朝阳;周燕;谭文松5.关节软骨细胞体外培养不同时间去分化现象发生过程及规律 [J], 杨柳;罗卓荆;胡蕴玉;靳小兵;颉强;吕荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。

三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。

2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。

3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。

四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。

含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞陈超;李光辉;陈安民【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2006(010)041【摘要】背景:成骨细胞原代培养技术已经很成熟,然而各种消化酶单纯作用于原代组织时对成骨细胞膜蛋白有一定影响.目的:为尽可能避免酶对细胞的损害,用含胎牛血清的胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织,进行体外成骨细胞培养,观察加入胎牛血清后胶原酶对成骨细胞消化的效果.设计:对照实验.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科研究室.材料:实验于2004-03/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科研究室完成.妊娠28 d日本大耳白种孕兔2只.方法:将同一个批号的Ⅰ型胶原酶分别用含体积分数为0.15胎牛血清的培养基和DMEM溶液配制成0.1%的含胎牛血清的胶原酶和0.1%不含血清的胶原酶,分别作为实验组和对照组的酶消化液A液和B液.妊娠28 d的孕兔,无菌条件下剖腹取出胎兔,然后取胎兔的颅盖骨,剔净、漂洗、剪碎.实验组和对照组分别加5 mL 37℃的A液和B液消化,两组均用含体积分数为0.15胎牛血清的培养液分别成梯度稀释为0倍、l倍、2倍和4倍后继续消化-培养成骨细胞.锥虫蓝染色测定细胞的存活率,细胞内碱性磷酸酶染色鉴定和测定成骨细胞的纯度,显微镜下观察细胞生长情况.主要观察指标:①用锥虫蓝染色来检测两组细胞的存活率.②以细胞内碱性磷酸酶染色来检测两组细胞的纯度.③用显微镜观察细胞形态来区别两组细胞的生长情况.结果:①细胞锥虫蓝染色结果:通过记数计算,实验组拒染率高达98%,细胞存活率高;对照组拒染率也高达95%,细胞存活率也较高.②细胞内碱性磷酸酶染色结果:实验组碱性磷酸酶染色阳性区域不少于95%,细胞纯度高;但对照组碱性磷酸酶染色阳性区域不超过75%细胞纯度较低.③显微镜下观察结果:实验组细胞饱满凸起,有立体感,细胞生长旺盛,营养充足;而对照组细胞凸起不明显,立体感较差,细胞生长营养较实验组差.结论:用含胎牛血清胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织,培养出的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征,且成分单一,存活率高.%BACKGROUND: The skill to culture osteoblasts primarily has been well developed, however, variousdigestive enzymes can affect membrane protein of osteoblasts when they are used on primary tissue separately.OBJECTIVE: To avoid the damage from enzyme to cell as best possible,digest cranial osseous tissue with collagenase in DMEM containing fetal bovine serum and carry out in vitro culture of osteoblasts, then observe the effect of collagenase in DMEM containing fetal bovine serum on the digestion of osteoblasts.DESIGN: Controlexperiment.SETTING: Department of Orthopaedic Surgery, Tongji Hospital Affiliated to Huazhong University of Science and Technology.MATERIALS: This experiment was carried out in the Department of Orthopaedic Surgery, Tongji Hospital Affiliated to Huazhong University of Science and Technology from March to December 2004. Two Japanese white rabbits with big ears that were pregnant for 28 days were used in the experiment.METHODS: Type I collagenase with the same batch number was prepared into 0.1% collagenase with fetal bovine serum and 0.1% collagenase without fetal bovine serum by using culture medium containing 0.15 volume fraction of fetal bovine serum and DMEM solution respectively, serving as the enzyme digestive juice A and B for experimental group and control group respectively. Abdominal delivery was performed to take ont the fetal rabbit which was at embryonic 28 daysunder aseptic condition.Then, craniums of fetal rabbits were dissected, rinsed and chipped into pieces. 5 mL solution A and 5 mL solution B were added into the experimental group and control group at 37℃, respectively. Culture solution containing 0.15 volume fraction of fetal bovine serum was gradiently diluted into 0,1,2 and 4 folds in each group, and continued to digest and culture osteoblasts. The cellular survival rate was measured with trypan blue staining, and the osteoblast and its purity were identified with alkaline phosphatase(ALP) staining. Cellular growth was observed under the microscope.MAIN OUTCOME MEASURES: ①Cellular survival rate of two groups was detected with trypan blue staining. ② Cellular purity of two groups was detected with ALP staining in the cells. ③Cellular growth was distinguished by observing cellular morphology under the microscope.RESULTS: ① Results of trypan blue staining: Through cell counting, the rate of cells, which refused to be stained, of the experimental group reached 98%, and the cellular survival rate was high; that of control group reached 95%, and the cellular survival rate was also very high. ② Results of ALP staining in the cells: The area of ALP staining positive of experimental group was not less than 95%, and cellular purity was very high; but that of control group was not more than 75%, and cellular purity was very low. ③ Observation results under the microscope: Cells of experimental group were well stacked, convex and stereoscopic, they grew prosperously and had enough nutrition; while those of control group were not significantly in comparison with experimental group.CONCLUSION: Collagenase containing fetal bovine serum is used to digest the osseoustissue of cranium of fetal rabbits, and the cultured osteoblasts have typical properties of osteoblasts with simple component and high survival rate.【总页数】4页(P223-225,封3)【作者】陈超;李光辉;陈安民【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,湖北省武汉市,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,湖北省武汉市,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,湖北省武汉市,430030【正文语种】中文【中图分类】R681【相关文献】1.Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞 [J], 刘长剑;刘建国;于铁成;罗宗键2.胶原酶一次消化法培养兔软骨细胞 [J], 宁旭;尚显文;尹培荣;吴承龙3.Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞 [J], 闫虎;苏友新;林学义;陈宝军;周必洪;张庆4.II型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞 [J], 闫虎;苏友新;林学义;陈宝军;周必洪;张庆;5.含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞(英文) [J], 陈超;李光辉;陈安民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

改良分步消化法培养原代软骨细胞田峰;崔学生;张帅;石玉泽;金群华【摘要】背景:胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道.目的:采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞.方法:将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养.培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响.结果与结论:酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h.两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h 后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底.结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞.%BACKGROUND: Combination of trypsin and bacterial collagenase to digest articulate cartilage matrix is widely used at home and abroad. Some studies have shown that the method steps is tedious, process is complicated, and cell is easy to pollution, but the better simple, safe and reliable method has rarely been reported.OBJECTIVE: To obtain highly purified and large amount of chondrocytes by improved stepwise digestion method. METHODS: Six 3-week-old New Zealand rabbits were divided into two groups: The experimental group was cultured by two-step enzyme digestion, and the control group was cultured by the traditional enzyme digestion method. The growth condition of chondrocytes was observed in the two group after 1 week,and cell counting and identification was performed. We estimated improved method to evaluate the influence of cells.RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the traditional method, this method spent shorter time to digest chondrocytes. After 24 hours, the primary chondrocytes in the two groups were mostly round at a suspending state. After 48 hours, the cells began to adhere. The results demonstrated that the improved method shortens digestion time, and easy to obtain a great amount of purified chondrocytes.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)020【总页数】3页(P3633-3635)【关键词】软骨细胞;关节软骨;细胞分离;原代培养;组织工程【作者】田峰;崔学生;张帅;石玉泽;金群华【作者单位】宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004【正文语种】中文【中图分类】R318背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂，容易污染，但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。

肝脏组织样品分离细胞的方法1.肝细胞的分离和培养分离方法：1. 肝组织展液的制备将肝组织放在前灌流液(含EDTA0.019％，pH 7．4，一定浓度的抗菌素)中带回实验室，剪去外露明显的血管和胆管组织。

前灌流液(预先在37℃水浴箱中浴热)用BRAUNULE穿刺针从管腔残端灌入，约3—5次，每次20 m1，尽量冲净肝组织中残存的血细胞，见肝组织呈谈红色或淡黄色，后用0．05％的胶原酶IV型水溶液15m1—20 m1，缓慢灌入3—4次，每次约5min—8min，胶原酶IV型可以重复使用，每次使用前均应在37℃水浴箱中浴热以保持酶活力。

待肝组织韧性消失，压迫不易恢复，肝包膜下有时呈粒状时，放入平皿中、用眼科镊剪去除被膜及肝组织内肉眼可见的管道系统，然后连同灌注流出的胶原配溶液放入锥形瓶中，在37℃水浴箱中振荡消化10min。

用培养液终止反应制成混合肝细胞悬液。

2. 分离培养肝细胞取混合肝细胞悬液用200目尼龙布过滤，50×g离心3min。

留下上清液作分离肝窦状间隙的内皮细胞用。

用1640培养液反复离心3次，每次50×g离心3min，以清洗残存的胶原酶和纯化肝细胞，在显微镜下观察肝细胞形态及纯化状态；用0.4％锥兰染色判断细胞活率，血细胞计数板计数细胞浓度。

以1640合成培养基(含10％AB型人血清)细胞混悬液稀释至2×l0E5／m1后分别接种在培养瓶和六孔培养板上。

在37℃、5％CO2条件下先培养l 8h—20 h，换液去除残存血细胞，再用同样培养基培养7d一10d。

2.间质细胞的分离和培养a.肝寨间隙内皮细胞分离、培养：取分离肝细胞后的上清液，用50×g离心3min和500×g离心5min交替离心3—5次，去除残存的肝细胞，同时用1640培养液清洗残存的胶原酶。

分出的细胞主要为肝内皮细胞和枯否氏细施的混合悬液。

用0.4％锥兰染色判断细胞活率后，接种在培养瓶中。

肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程体外培养是指将组织或细胞从体内分离出来，在适当的培养基中提供养分和环境条件，使其继续生长和繁殖。

肝细胞是人体内重要的细胞类型之一，其体外扩增培养可以为肝脏疾病的研究提供便利，如药物代谢、药物筛选、肝移植前的肝细胞修复等。

以下将介绍肝细胞的体外扩增培养方法、应用与流程。

1.肝细胞的体外扩增培养方法：(1)感应体外培养法：将组织切割成小块，用胶原酶等消化酶处理后，将细胞悬浮液接种于培养基中，经一段时间后，原始肝细胞将逐渐扩增生长。

(2)富集法：通过密度梯度离心或特异性细胞表面标记等方法，获得较纯的肝细胞种子，然后进行体外培养。

2.肝细胞的体外扩增培养应用：(1)药物代谢研究：利用体外培养的肝细胞，可以研究药物在体内的代谢途径、药物与代谢酶的相互作用等，为新药的研发和药物安全性评价提供依据。

(2)药物筛选：通过将已知化合物或新药接种于体外培养的肝细胞中，观察其对细胞生长、代谢活性的影响，判断化合物或药物的毒副作用、有效性等，并进行初步筛选。

(3)肝细胞移植前的修复：利用体外培养的肝细胞，进行相关修复试验，在肝脏移植前进行治疗，以快速修复受损肝细胞，减少术后并发症。

3.肝细胞的体外扩增培养流程：(1)细胞的获取：从人体器官获得肝组织，迅速放入无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中清洗，去除表面的血液和残留物质。

(2)细胞的分离：将肝脏组织切割成小碎片，加入含胶原酶等消化酶的消化液消化，分离出单个肝细胞。

(3)细胞的培养：将分离得到的肝细胞悬浮液接种于含有细胞培养基、血清和生长因子的培养瓶中，放置于恒温培养箱中，提供适当的培养条件，如温度、湿度、CO2浓度等。

(4)培养基的更新：根据需要，定期更换培养基，以保证细胞的生长和代谢所需的养分和环境条件。

(5)细胞的观察和评估：观察并记录细胞的生长状况、形态变化等，通过细胞计数、代谢指标测定等方法评估其活力和增殖能力。

(6)细胞的扩增和存储：根据需要，将培养后的肝细胞分为多个瓶子进行扩增，同时可将部分细胞进行冻存，以备后续研究使用。