组织块法和消化法

细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。

（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。

(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。

不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。

若必须推迟，可保存在4℃，72h。

1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。

再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。

静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。

2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。

分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。

置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。

一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。

注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。

2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。

由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较目的比较体外分离培养成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法。

方法滑膜组织来自关节镜清洗术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法分离培养FLS。

采用倒置相差显微镜以及流式细胞术对第3～4代FLS 进行鉴定。

结果2种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。

传代可使FLS 达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜观察均符合FLS的形态结构特征，流式细胞术检测示CD44以及CD90呈强阳性，CD55呈弱阳性。

组织块法培养法FLS成功率较高，细胞游出时间较早，细胞损伤小。

结论组织块培养法适合于FLS的培养，第3～4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。

[Abstract] Objective To compare the isolated methods for fibroblast-like synoviocytes (FLS). Methods Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by digestive enzyme culture and tissue culture. The 3～4 generation FLS were identified by morphology and flow cytometry. Results These two methods could culture FLS successfully, tissue culture method was better than the digestive enzyme culture method. FLS showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope. CD44 and CD90 were strong positive, and CD55 was weak positive in the FLS cell surface. Tissue culture method had higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. Conclusion Tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from synovium tissue. And purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.[Key words] Fibroblast-like synoviocyte; Cell culture; Separate training; Rheumatoid arthritis類风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病[1]。

原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。

原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。

其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。

其培养方法如下：(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

鼻黏膜上皮细胞培养路线方法一：分离细胞培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织进行冲洗，将菲薄的黏膜层从黏膜下组织小心地翻揭分离下来（略呈黄色的一面是上皮层）→黏膜剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化（37℃孵育30min）→消化后在上述有黏膜块的酶溶液内直接加入等量的0.25%胰蛋白酶，轻轻吹打5min →移除黏膜块，细胞悬液进行离心（黏膜块可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗后再予去除，冲洗液也同样进行离心）→沉淀中加入适量含血清培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。

方法二：组织块培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织块进行冲洗、浸泡、并剪碎（1mm×1mm大小）→黏膜块剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化（37℃孵育过夜）→离心（1000r/min，4℃5min）→弃去上清，沉淀中加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。

方法三：ABC培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织块进行冲洗、浸泡、并剪碎（1mm×1mm大小）→黏膜块剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶(酶量为组织块体积的5倍)消化（37℃孵育过夜）→第2天取出，轻轻吹打，将细胞悬液移走，组织块留在培养瓶内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中。

采用ABC贴壁法行原代培养。

即取A、B、C3个培养瓶。

将细胞悬液先种于A瓶，在CO2培养箱中孵育10min，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中到瓶角后慢慢吸出全部培养液，接种到B瓶，CO2培养箱中孵育10min，同法将细胞悬液转入C瓶中。

控制培养液液面高度在2-5mm，以去除鼻黏膜上皮细胞中的成纤维细胞和红细胞。

再置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中孵育24h，培养液更换为含生长因子培养液，隔日换液1次。

脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。

脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。

一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。

2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。

脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。

二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。

2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。

三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。

2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。

通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。

在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。

脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。

希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。

第三部分 病毒学实验方法病毒是微生物中体积最小的一种，绝大部分在普通光学显微镜下不能看到，需用电子显微镜才可查见。

由于病毒具有严格的寄生性，必须在易感的活组织(细胞)中才能增殖，故通常将其接种于动物(小鼠、家兔及猴等)、鸡胚胎或组织(细胞)中使之增殖，但并非所有标本均需依次接种于动物、鸡胚胎或组织培养中进行病毒的分离鉴定，而是根据具体情况而定。

有些病毒在寄生的细胞内增殖后可导致细胞病变，或可在受感染的细胞内形成形态学上特异的斑块，称为包涵体，此可用普通光学显微镜检视。

病毒性疾病常用的血清学检查法为血凝抑制试验、补体结合试验及中和试验。

近年来，随着科学技术的进展，在原有血清学检查技术的基础上，又建立了具有特异性强且敏感性又较高的新的血清学检测法，如荧光抗体检测技术，酶联免疫检测技术—EILSA及固相放射免疫技术等，在实际工作中，可随检查目的的不同而选不同的方法。

实验十五 病毒感染后的形态学观察一、电子显微镜技术病毒体积微小，不仅肉眼看不见，即使是分辨率最好的光学显微镜也只能看到个别的大病毒。

20世纪30年代初电子显微镜的发明，扩大了人们的视野。

在电子显微镜下，不仅能观察到各种病毒的外观，且可看清其结构。

为了观察病毒与细胞的关系。

一般将接种病毒的组织（细胞）培养固定，包埋后进行超薄切片，染色后进行观察；为观察病毒形态与结构，可用磷钨酸负染法。

(一)磷钨酸负染法磷钨酸负染法是利用重金属盐类溶液处理生物标本，使它在电镜下呈现出良好的反差。

经此种染色处理的生物标本。

在电镜下与正染色相反，观察到的不是亮环境下的黑色物象而是暗背景(重金属染液)下的亮象(物体)。

【材料】(一)病毒悬液。

(二)染液：磷钨酸盐(钠、钾)(三)铜网【方法】(一)用吸管吸取少量病毒悬液，直接滴在铜网上，一般每份标本3-4个铜网。

待3-5 min 后吸去悬液或用小片滤纸吸干。

然后用另一吸管吸染液滴于铜网上，待2-3 min吸去多余染液，待自然干燥后即可进行电镜观察。

细胞分离常用方法一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的TD4A低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。

二、实体组织材料的细胞分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

(一)机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。

此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。

此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

(二)消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：(1)胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。

胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。

细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。

组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。

有时泛指所有的体外培养。

器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。

无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。

完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。

接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。

无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。

注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。

但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。

不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。

原因：培养条件变化使分化发生阻抑细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。

原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。

培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。

传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。

1）体外培养细胞，其生长方式主要有贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁细胞和悬浮细胞。

2）一般可将贴壁细胞生长的体外培养细胞大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多行细胞型四种类型，最常见的为前两种。

3）体外培养细胞的主要生长特点：①贴附生长②接触抑制③密度依赖性培养细胞分化状态的变化：①去分化（脱分化）②不适应1、细胞培养的基本要求有哪些和工作方法要求：1）培养前准备2）操作间消毒3）洗手和着装4）火焰消毒培养前的准备的基本要求：培养基的选择和无菌配制动物细胞培养用液的类型、配制和无菌处理方法：1）操作程序规范2）试剂设备专人负责3）培养用品定点存放2、平衡盐溶液（BBS）：（1）成分：无机盐和葡萄糖，少量酚红。

细胞分离常用方法一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的TD4A低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。

二、实体组织材料的细胞分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

(一)机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。

此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。

此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

(二)消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：(1)胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。

胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。

肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时能加入生长因子或原患者血清（1%~2%）以利细胞生长。

培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。

1．组织块法
将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。

2．酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。

以（5~10）x108个/L 细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。

3．钽网法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（1~2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，
再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。

4．脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，7~10天上皮细胞逐渐长成单层。

初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。

加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

三种方法原代培养人牙周膜细胞蒋俊强;王忠朝;黎春晖;蔡炜【摘要】背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础.牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一.如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一.目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法.方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线.结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%).3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好.第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期.提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)023【总页数】5页(P4290-4294)【关键词】人牙周膜细胞;细胞培养;组织块法;酶消化法;酶消化结合组织块法【作者】蒋俊强;王忠朝;黎春晖;蔡炜【作者单位】泸州医学院附属口腔医院口腔内科,四川省泸州市,646000;泸州医学院附属口腔医院口腔内科,四川省泸州市,646000;泸州医学院附属口腔医院口腔内科,四川省泸州市,646000;泸州医学院附属口腔医院口腔内科,四川省泸州市,646000【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言细胞培养技术是细胞生物学研究的基础[1]。

从组织中分离的原代细胞较好地保存了原组织细胞的遗传特征和生物学特征[2]。

体外培养的人牙周膜细胞(human periodontal ligament cell，hPDLC)对研究牙周细胞生物学、药理学、毒理学以及牙周组织工程研究具有重要意义[3-7]。