肿瘤体外药敏检测01(完整)

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肿瘤药敏检测技术

靶向药的靶向机制决定了基因检测的必要性和临床意义
基因检测指导靶向用药结果不理想下可作为备选方案
日本进入医保中国临床应用较多
用药指南未规定临床应用较少
国外伴随诊断市场快速增长；进入用药指南和医保
用药指南未规定
2
一、药敏检测技术需求分析
➢ 临床需求——精准医疗下肿瘤用药指导：药物敏感性、耐药性、副作用等
13
二、药敏检测技术路线
• 2D细胞模型——ATP-TCA生物荧光药敏检测
荧光素酶改造 • 改造目标：提高灵敏度、稳定性 • 改造流程可如下所示：
合成北美萤火虫荧光素酶基因
设计点突变引物，定向突变荧光酶潜在的多个活性相关位点
通过蛋白工作站，纯化生产重组荧光酶
筛选得到灵敏度和稳定性高的克隆
四唑蓝比色法 (MTT)
简便、快捷、费用低
敏感性较差，最低仅能检测500个细胞；量程较小，有效量程在2.0以内。
ATP生物荧光法
敏感性好（可检测最少10个细胞）、可评价率高、快速检测、
精密度好、具备产业化条件
——
野生型荧光素酶通常稳定性较低，如在体外 37℃放置3分钟即失活。
海创生物的ATP-TCA技术核心： 1、化学结构改良的ATP荧光素酶，稳定表达荧光强度 2、肿瘤选择性培养基
微镜对胶滴中细胞的染色情况进行扫描，通过图像软件设定
亮度阈值，排除染色较浅的成纤维细胞, 计算肿瘤细胞形成
清除血细胞、死细胞、的克隆的OD值，计算出药物的抑制率。
非细胞杂质
实例2：使用达瑞生物的DR6690进行图像采集和分析
收集活细胞重新分散后与胶原凝胶混合，制成胶滴
胶滴培养一定时间
胶原可外购，如 Sigma、Fluka的I型胶原蛋白

吉西他滨对膀胱癌细胞敏感性的实验研究

吉西他滨对膀胱癌细胞敏感性的实验研究杨鹏;刘振湘;张冲【期刊名称】《海南医学院学报》【年(卷),期】2013(019)010【摘要】目的:探讨吉西他滨体外对人膀胱癌T24细胞株,以及对不同个体膀胱癌细胞生长抑制的影响,明确吉西他滨对膀胱癌细胞有无明显抑制效应,是否适用于浅表性膀胱癌的术后灌注化疗.方法:体外培养膀胱移行细胞癌T24细胞,用生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)检测不同浓度吉西他滨对肿瘤胞生长抑制的影响,光学显微镜观察不同时间段肿瘤细胞形态学变化.收集我院经尿道膀胱肿瘤切除术的40例浅表性膀胱癌患者的新鲜肿瘤标本,应用ATP-TCA技术检测肿瘤细胞对的吉西他滨的敏感率.结果:T24膀胱癌细胞株对吉西他滨表现为耐药；吉西他滨作用T24膀胱癌细胞株一定时间后,与对照组相比未见明显细胞凋亡或坏死；ATP-TCA 法检测40例不同个体膀胱癌细胞对吉西他滨耐药率为90％.结论:吉西他滨体外对膀胱癌T24细胞株无生长抑制作用,对40例不同个体膀胱癌细胞耐药率为90％,初步说明该药不适合浅表性膀胱癌的术后灌注化疗.【总页数】4页(P1368-1371)【作者】杨鹏;刘振湘;张冲【作者单位】中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科,海南海口 570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科,海南海口 570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科,海南海口 570208【正文语种】中文【中图分类】R737.14【相关文献】1.姜黄素增强胰腺癌细胞移植瘤对吉西他滨化疗敏感性的实验研究 [J], 张洪军;张兆伟;刘峰;曹家忠;李磊;王亚征2.VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究 [J], 袁顺辉;王剑松;李泽惠;詹辉;李天庆3.人工合成拟Smac多肽增强膀胱癌细胞化疗敏感性的实验研究 [J], 曾甫清;王竞;汪良;蒋国松4.吉西他滨对膀胱癌细胞敏感性的实验分析 [J], 刘秋莲5.超声辐照增强胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的实验研究 [J], 王俊峰;何鑫;高美娟;姜婷;单悦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

肿瘤体外药敏试验与临床实用研究进展

性和化疗的疗效。ＡＰ— ＣＴＴＡ是通过测定细胞内源性ＡＰ的含量从而反Ｔ
映化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力，在肿瘤细胞数量很少的时候也能检测到较高数值，有高敏感性、具技术检测结果与体内治疗反应具有高度的一致性。成为除ＭＴ法之外在临１ｒ床上也较多用的肿瘤体外药敏试验方法，已被制成试剂盒并在国外应用较多］Ｔ。ＡＰ是活细胞的基本能量单位，当细胞的代谢受损时，ＴＡＰ合成下降，细胞死亡时受酶的作用ＡＰＴ迅速水解消失，ＴＡＰ水平与活细胞数量呈正相关，故通过测定其水平可反映生物体的增殖活性。ＡＰ体外药敏试验的Ｔ原理是细胞内ＡＰ与荧光素酶复合物作用产生可测定荧光，Ｔ检测荧光值计算出ＡＰ量可反映活细胞数。１８Ｔ９８年Ｓｖｎ等选择２ｅｉ４孔培养板，采用软琼脂半固相底层与液相上层为基础的双层培养法，２将２例卵巢癌细胞在体外与不同化疗药物培养５天一７天，ｆ缓冲液中和后加入ＡＰ抽ｒｓｉＴ提液，置于发光仪中计数，ＡＰ荧光值下降的比值来判断据Ｔ其对化疗药物的敏感性，出该试验方法敏感性为８．％，得９５特异性为１０，性预测值为１００，性预测值０％阳０．％阴为６．％。多数研究认为，６７对乳腺癌手术后组织的可评价率
技术；９０年Ｋｒ１９ｅｎ和Ｗｅｓｎｈ临床试验表明体外药敏试ｉｔａｅｌ验可用来预测病人对药物的治疗反应；９３年Ｆｕｈｕ１９ｒｅａｆ和Ｂｓｑｅ临床试验表明肿瘤体外药敏试验的结果和患者生ｏａｕｔｎ存率有显著关系；００年在国外一些国家抗癌药物敏感性试２０验进入了医疗保险；０１年Ｋｒａｈｒ道肿瘤体外药敏试２０ｕｂｃｅ报验指导下的化疗可能改善患者的预后。

GST-π在卵巢恶性肿瘤组织中表达的临床意义

GST-π在卵巢恶性肿瘤组织中表达的临床意义张化莲;李文涛【期刊名称】《医药论坛杂志》【年(卷),期】2007(28)3【摘要】目的检测卵巢恶性肿瘤组织中谷胱甘肽S转移酶(GST-π)的表达,并探讨其与其多药耐药的关系。

方法采用体外药敏实验(MTT法)和免疫组织化学方法对73例卵巢恶性肿瘤组织进行GST-π表达的检测,并对相关的临床病理因素进行分析。

结果①卵巢恶性肿瘤组织中GST-π表达阳性率为67.1%,且GST-π在临床III^IV期的阳性表达率89.2%,显著高于I^II期的阳性表达率44.4%(P<0.01),而GST-π在G3中的表达率均大于G1~G2,但相比差异无显著性。

②GST-π的表达与卵巢恶性肿瘤的耐药性呈显著的正相关(P<0.05),其不同表达程度间也有着显著性差异(P<0.05)。

结论GST-π参与了卵巢恶性肿瘤组织中存在固有化疗耐药性,GST-π表达的检测可以预测临床卵巢恶性肿瘤化疗敏感性,指导临床化疗方案的选择。

【总页数】2页(P58-59)【关键词】卵巢恶性肿瘤;多药耐药;谷胱甘肽转移酶;体外药敏实验;免疫组织化学方法【作者】张化莲;李文涛【作者单位】驻马店市中心医院妇产科;郑州大学第一附属医院【正文语种】中文【中图分类】R737.31【相关文献】1.GST-πmRNA在胃癌组织中的表达及临床意义 [J], 胡秀学;刘跃;王鹏;何月;李鑫;高波;杜娟2.TopoⅡ、P170、GST-π、PCNA及E-Cadherin在乳腺癌组织中的表达及临床意义 [J], 李宏;廉斌;王建;曾涛;李金平3.P-gp、GST-π、TopoⅡ及LRP在胃癌组织中的表达及其临床意义 [J], 李红;朱伦;李跃武;王茜4.胃癌组织中GST-π的表达及临床意义 [J], 王秀清;王坤华;贾丽婷5.胃癌组织中GST-π的表达及临床意义 [J], 王秀清;王坤华;贾丽婷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

抗肿瘤药物临床应用管理试题

抗肿瘤药物临床应用管理试题单选题，共50题，每题2分L医疗机构抗肿瘤药物管理的第一责任人是OA.医疗机构主要负责人（正确答案）B.医务科负责人C.药剂科负责人D.肿瘤科负责人2.《抗肿瘤药物临床应该管理办法（试行）》规定，（）以上医疗机构定期对本机构抗肿瘤药物相关的医师、药师、护士进行抗肿瘤药物临床应用知识培训并考核。

A.三级B.二级（正确答案）C. 一级D.以上都不是3.经临床长期应用证实安全.不良反应轻微用药方法简单.价格低廉的普通药物，在抗肿瘤药物分级管理中属于（）A.普通使用级（正确答案）B.限制使用级C.特殊使用级D.以上都不是4.《抗肿瘤药物临床应该管理办法（试行）》规定，抗肿瘤药物临床应用应当遵循O的原则A安全B.有效C.经济D.以上都是（正确答案）5.药物毒副作用大，上市时间短.用药经验少，价格昂贵的药物，在抗肿瘤药物分级管理中属于（）A.普通使用级B.限制使用级（正确答案）C.特殊使用级D.以上都不是6.以下医生具有限制使用级抗肿瘤药物处方权限的是（）A.执业医师B.副主任医师（正确答案）C.主治医师D.初级医师7∙环磷酰胺属于（）抗肿瘤药物A.烷化剂类（正确答案）B.抗代谢类C.抗生素类D.伯类8∙下列哪个瘤种不建议使用甲氧氯普胺进行化疗后的止吐（）A.乳腺癌（正确答案）B.非小细胞肺癌C.肝癌D.胃癌9∙作用机制为抑制二氢叶酸还原酶，阻碍肿瘤细胞DNA的合成的药物是（）A.阿糖胞昔B.长春碱C紫杉醇D.甲氨蝶吟（正确答案）10∙作用机制为抑制有丝分裂的药物是：（）A.长春新碱（正确答案）B.紫杉醇C.三尖杉酯碱D.他莫昔芬11.关于化疗药物的用药顺序，以下说法错误的是（）A.先用顺伯后用紫杉醇（正确答案）B.先用亚叶酸钙后用氟尿口密咤C先用长春新碱后用环磷酰胺D.先用甲氨蝶吟后用氟尿喀咤12.只能用5%葡萄糖做溶媒的化疗药是（）A.吉西他滨B.奈达伯C.依托泊昔D.奥沙利伯（正确答案）13根据（）结果得出的临床诊断，没有抗肿瘤药物治疗的指征A.组织学病理确诊B.细胞学病理确诊C.特殊分子病理诊断D.临床症状.体征和影像学结果诊断（正确答案）14.对于新型抗肿瘤药物（小分子靶向药物和大分子单克隆抗体类药物），有明确靶点的药物，须遵循（）后方可使用的原则。

矿产

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。

浅谈肿瘤化疗药敏试验方法

关键词：抗癌药；药敏试验；检测；肿瘤
如何更有效地筛选应用抗肿瘤药物，预测个体肿瘤对药物的敏性的判断方法是，利用图像分析装置，依据肿瘤细胞和成纤维细胞的感Ｊ生，指导临床治疗以提高疗效早已成为临床化疗界瞩目的问题。近增殖形态和中性红染色程度的差异计算出肿瘤细胞克隆的体积值，进年来，肿瘤药敏试验指导的个体化治疗的研究，受到国内外肿瘤界的而计算出抗肿瘤药物处理组（Ｔ）和非处理组（ｃ）之间的相对增殖率之重视。国际上，相继建立了一系列药物敏感Ｉ生试验技术。应用人类新鲜比（即值）。Ｔ／ｃ值在５０％以下的被认为肿瘤对该试验药是敏感的。
【技术原理】【技术原理】基于以整体细胞群杀灭概念为基础，同时检测分裂细胞和非分ＡＴＰ生物荧光技术产生于２０世纪７０年代中期。１９８３年，Ｍｏｙｅｉ一裂细胞，从而维持肿瘤细胞群体的异质眭。因为肿瘤难治的主要原因等提出内源性三磷腺苷的数量可以反映细胞的活性度。随后，Ｋａｒｃｍ是其与肿瘤细胞群体中有可逆的非分裂细胞（即Ｇｏ期细胞）的杀灭
２四氮唑（ＭＴＴ）比色法
பைடு நூலகம்
【技术原理】活细胞特别是增殖期细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶将黄色的Ｍ１代谢产物５一氟一２一脱氧尿苷＿５ — 磷酸和ＤＮＡ合成形成牢固立体的共代谢为深蓝色的甲躜晶体，ＦＧＦ二甲基亚砜ＤＭＳＯ溶解晶体后，价复合物，而阻滞ＤＮＡ合成；另外，５＿Ｆｕ最终被ＤＰＤ等三种分解为５７０ｎｍ波长测量Ａ值并判断结果。近年来，ＭｒＩＴＩ１法在几乎所有类型肿氟一Ｂ一丙氨酸而排泄，ＤＰＤ活性和５一Ｆｕ抗肿瘤效果呈负相关。瘤药敏试验中应用，其可评率高、简易快速、观察终点客观。ＭｑＴ法也【技术特点】有多种改良，如用软琼脂培养，减少正常细胞生长；于ＭＴｒ溶液中加通过检测肿瘤组织内ＴＳ、ＤＰＤ潘陆可预测对５－Ｆｕ的敏感性，进步以ＲＴ－ＰＣＲ等分子生物学技术检测内镜下获得的微量组织标本【技术特点】中ＴＳ、ＤＰＤ的ｍＲＮＡ表达情况，可由于肿瘤的恶性性质及目前肿瘤Ｍ１Ｔｒ法有众多优点，被认为是简便、快捷、经济的药敏方法。治疗的现状，医师和患者均希望有能够准确预测化疗药物敏感『生的方３胶原凝胶包埋培养药物敏感・眭实验法，能否与临床实际相符合是医师考虑的首要因素，价格、操作难易程【技术原理】度、需要的时间也在考虑范围之内。随着人们对药敏试验的不断重视，是先通过特定的酶消化９中瘤细胞外基质，单纯回收细胞成分，再以及方法上的不断改良，或出现了新的药敏测试方法，从而能进一步将这些细胞成分包埋于人工的细胞外基质，即Ｉ型胶原凝胶中，以此提高肿瘤化疗效果，改善患者的预后。在这种情况下，开发对肿瘤敏感构成—个与体内相似的微环境，并将它们放置于近似于体内的环境中药物的新筛选方法，从不断增多的各种治疗方案中选择对患者最合适进行三维立体培养，然后进行药敏试验。ＣＤ－ＤＳＴ的药物抗肿瘤敏感的抗肿瘤药越来越重要，已成为临床化疗界瞩目的重要问题之一。

MTT法体外测定胃癌化疗药物敏感性

文章编号:1005-6947(2003)01-0047-03·简要论著·M T T法体外测定胃癌化疗药物敏感性陈亚军1,叶古祥1,孙国娣2(上海市杨浦区中心医院普外科,上海200090) 摘要:采用MTT法测定89例胃癌细胞对10种化疗药物的体外敏感性,并运用免疫组化法检测30例肿瘤细胞的多药耐药基因(MDR1)。

结果显示89例胃癌细胞对化疗药物的敏感性依次为52FU>MMC>ADM>HCPT>CBP>CDDP>MXT>MTX>Ara2C>VP16。

30例患者中15例MDR1阳性。

笔者认为以MTT法检测胃癌细胞对化疗的敏感性有助于指导临床选用肿瘤敏感性化疗药物,并可避免盲目选用肿瘤非敏感性化疗药对机体造成的毒性反应。

在检测肿瘤对化疗药物敏感性的同时,应检测多药耐药基因,及时发现耐药病人,以便采用其他有效的治疗方法。

关键词:胃肿瘤/药物疗法;药物筛选试验,抗肿瘤;MTT法,肿瘤多药耐药基因中图分类号:R735.2;R965.1 文献标识码:B 大多数胃癌患者术后需要化疗,有效的化疗药物与化疗方案有助于提高胃癌的总体疗效,因此建立体外抗癌药物敏感性试验来筛选化疗药物,一直是临床化疗中备受瞩目的问题。

Mosman(1983)建立的噻唑兰(MTT)显色法优于其他体外化疗药物敏感性试验。

本研究用MTT法检测胃癌对体外化疗药物的敏感性,并探讨与肿瘤多药耐药基因(MDR1)之间的关系,为临床选择化疗药物提供参考。

1　材料与方法1.1　临床资料本组89例,男54例,女35例。

年龄平均为(58.3±12.8)岁。

均病理证实为胃癌,其中腺癌52例,低分化腺癌26例,黏液细胞癌6例,印戒细胞癌5例。

采用免疫组化二步法———优选即用型一抗加EnVision(DA KO公司提供的EnVision抗体)检测MDR1。

1.2　胃癌细胞制备术中切取胃癌部分肿瘤组织于无菌条件下快速送实验室。

矿产

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。

药敏试验(扩散法)操作方法

12
药液的制备（用于商品药的试验）：
按兽药说明书(或标签)上标明的治疗量的10-20倍比例配制药液。如某药品：100g兑水100kg，表明该药治疗量为1g兑水1L，配制药液时就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g药品，即为配制药敏片所用的药液浓度。
抗菌药的稀释剂通常用纯化水。
99.5ml
将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。
7
1、培养基
MH肉汤（MHB） Mueller-Hinton Broth 用途：用于抗生素敏感试验配方：（g/L）
牛肉粉
2.0
可溶性淀粉
1.5
酸水解酪蛋白
17.5
pH值 7.4 ± 0.2
25℃
原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、维生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代谢产物。
说明：
不同厂家标示成分及含量相同的成品制剂在用成品做成药敏时常出现显著差异（包括同一厂家生产）
由于在进行成品制作时常加入一定量的辅助成份，其对药敏试验结果常造成较大影响，所以成品药敏试验结果并不能完全显示成品的真实结果。
不能用单药的药敏结果代替成药进行用药。（标示与真实成份及含量有很大差别）
简易药敏片的制法
纸片的准备：
1、取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
2、药片吸水量的测定在上述药片用微量移液器进行滴加蒸馏水，最可使药片完全浸透又不滴水为宜，最终计算出每片药片的吸水量。一般常用直经6mm的定性滤纸药片吸水量为0.01ml。

MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性汇总

MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性摘要：目的探讨3-(4.5)-双甲基-2-噻唑-(2.5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

方法采用改良的MTT法检测了189例恶性肿瘤标本对9种化疗药物的体外敏感性。

结果51例胃癌细胞对化疗药物的敏感性，由高到低依次为丝裂霉素(MMC)，5-氟脲嘧啶(5-Fu)，顺铂(DDP)，阿霉素(ADM)，阿糖胞苷(Ara-C)，平阳霉素(PYM)，甲氨喋呤(MTX)，足叶乙甙(VP-16)，长春新碱(VCR)；75例结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性，由高到低依次为5-Fu，MMC，PYM，VP-16，MTX，VCR，DDP，Ara-C，ADM。

43例肝癌细胞对化疗药物的敏感性，由高到低依次为DDP，MMC，5-Fu，ADM，MTX，Ara-C，VP-16，PYM，VCR；20例乳癌细胞对化疗药物的敏感性，由高到低依次为5-Fu，MMC，DDP，ADM，MTX，PYM，VCR，Ara-C，VP-16。

结论MTT法快速、简便、敏感性高、可评价率高，适用于恶性肿瘤的药敏试验，对临床用药有指导意义。

关键词：抗肿瘤药，多剂联用；药物敏感试验； MTT法中分类号：R979.19 文献标识码：B抗癌药物体外敏感性试验一直是临床化疗界瞩目的问题。

现今已建立了多种肿瘤化疗药敏试验方法，但因成功率低和受试条件限制，都未能在临床推广应用。

由Mosman(1983)［1］建立的MTT显色法是近年来用于验测药物对肿瘤细胞增殖影响的新指标。

MTT法具有简便、快速、有一定的特异性等优点，作者采用MTT法对189例恶性肿瘤细胞的体外药物敏感性进行了初步的研究，报告如下。

1 材料与方法1.1 药品与试剂阿霉素(ADM，意大利爱宝大药厂)，顺铂(DDP，山东齐鲁制药厂)，5-氟脲嘧啶(5-Fu，上海旭东海普药业有限公司)，甲胺喋呤(MTX，上海华联制药有限公司)，丝裂霉素(MMC，日本协和发酵工业株式会社)，长春新碱(VCR，中国民生药厂)，平阳霉素(PYM，天津太河制药有限公司)，阿糖胞苷(Ara-C，北京医科大学实验药厂)，足叶乙甙(Vp16，北京制药工业研究所实验药厂)。

肝癌腹水癌细胞、白细胞体外抗癌药物敏感相关性研究

２结果
大部分肝癌患者腹水癌细胞对顺铂、铂、卡阿霉素
低毒高效的问题，时也要关注到患者个体差异所产同生的影响。个体存在抗药基因的不同导致了药物代
△
通讯作者
・
１９２・２
四川医学２１０１年８月第３２卷（８期）ＳｃｕｎＭｅｉｌｏｒａ，０１ＶＬ２Ｎ．第ｉａｈｄａｕｎｌ２１，ｏ３，ｏ８ｃＪ
加Ｈｎ ’ 液，组设３个复孔，３ ℃ 、％Ｃ箱ａｋＳ每置７５Ｏ孵
肝癌是我国发病率高、危害严重的恶性肿瘤之一。肝癌患者恶性腹水是临床常见症状之一，治疗比较困难。由于患者的个体差异以及肿瘤细胞耐药性突变和
抗癌药物对正常细胞的杀伤，给选用合适的药物带来
一
１２化疗药物：．顺铂（Ｄ，ＤＰ中国齐鲁）５氟尿嘧啶；一（一Ｕ，５Ｆ天津金耀）卡铂（Ａ，；ＣＰ中国齐鲁）丝裂霉素；
ｄｃｄｂｔｃｎｅｒｇ．ＲｅｕｔＩｈｂｔｎｏａｃｎｍａｃｌｒｍｙｒｇｓｒｉｄｃｄｂａｂｐａｉｃｓｌｔｄａｒａｕｅｙａｉａｃｒｄｓｎ — ｕｓｌｓｎｉｉｏｃｒｉｏｅｓｆｏｈｄｏａｔｎｕｅｙｃｒｏｌｔｉｆｅｎ，ｉｐａｉａｄｉ — ｎｎ
【文献标识码】Ａ
【文章编号】１０－０（０１０— ９－０４０１２１）８１１２－５２０

项目7药物体外抗菌试验技术

• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌 CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行，生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
选择性培养基
❖ 阴性对照及阳性对照
1.
阴性对照
2.
阳性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身是无菌可靠的；阳性对照试验必须长菌，说明应用的细菌是可以在该试验条件下正常生长的。
❖ 抑菌试验
❖ 无菌检查法
❖
无菌检验结果判断
•
需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌
CMCC(B)28001
绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不
得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨
01
直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再用放大镜或解剖镜观察。
02
04
分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药物６cm上放置６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h. 螨有避光怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。

ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测方法的应用探讨

较高的临床符合率。结论：开展ＡＴＰ一生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测对临床治疗用药具有重要的指导意义。
【关键词】
肿瘤细胞；药物敏感试验；可行性【文献标志码】Ａ【文章编号】１００７ — ８５１７（２０１３）２３ — ００２８ — ０３
中国民族民间医药
・
学术探讨
Ａｃａｄｅｍｉｃｓｔｕｄｙ
２８・
Ｃｈｉｎｅｓｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｅｔｈｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄｅｔｈｎｏｐｈａｎｎａｃｙ
【中图分类号】Ｒ９６９．３
化学治疗是治疗恶性肿瘤的三大治疗手段之一，由于
肿瘤患者存在个体差异及肿瘤的异质性，肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异ｌ２，特别是肿瘤复发和经过多
次化疗的患者。因化疗前缺乏患者对化疗药物敏感性和耐药性的直接检测证据，在制定化疗方案时不可避免地存在
～
１．２化疗药物化疗药物为１００％药物血浆峰值浓度（１００％
ＰＰＣ）（见表１）。联合用药的每个药物的浓度与单药浓度相同。
表１化疗药物及剂量
４Ｘ１０６个／ｍｌ备用。
１．４．３加待测药物于９６孔培养板，每个药物设１００％、５０％、２５％、１２．５％和６．２５％ＰＰＣ５个浓度，每个浓度２个平行孔，并设无药对照组（ＭＯ），和最大抑制对照组（ＭＩ）。接种所得肿瘤细胞，细胞数为２Ｘ１０４个／孔。在３７ ℃ ，５％ＣＯ：条件下培养５ｄ后，开始测定。最大抑制对照孔加５０ｌ最大抑制剂，其余各孔加５０￣ＩＡＴＰ提取液，在震荡器上震荡３０ｓ，室温静置５ｍｉｎ。再次震荡？昆匀。每孔取５０ｌｘｌ液体，按相应的位置加到荧光测试板内，每孔加入

胶滴肿瘤药敏检测技术

和效率。
临床转化
随着研究的深入和技术的不断完善，胶滴肿瘤药敏检测技术将逐渐转化为临床应用，为更多肿瘤患者提供精准治疗。
多学科融合
该技术将与分子生物学、基因组学等多学科进行融合，从更广泛的领域研究肿瘤耐药机制和新型抗肿瘤药物的开发。
05
胶滴肿瘤药敏检测技术的实际应用案例
在临床治疗中的应用案例
研究二
某研究团队使用胶滴肿瘤药敏检测技术对某种罕见肿瘤进行研究，发现该肿瘤对某一种药物敏感，为该肿瘤的治疗提供了新的思路。
在药物研发中的应用案例
案例一
某制药公司使用胶滴肿瘤药敏检测技术对多种候选药物进行筛选，筛选出最有可能有效的药物进行进一步研发。
案例二
某制药公司使用胶滴肿瘤药敏检测技术对某种新药进行药效评估，发现该药物对某种肿瘤的治疗具有较好的效果，推动了该药物的研发进程。
未来趋势
随着精准医疗理念的深入人心，胶滴肿瘤药敏检测技术将会得到更加广泛的应用。未来，该技术将会与基因检测等其他技术相结合，为患者提供更加全面、精准的个性化治疗方案。
02
胶滴肿瘤药敏检测技术的基本原理
肿瘤细胞的耐药性
肿瘤细胞对药物失去敏感，不再被药物所作用。
肿瘤细胞可能通过多种机制产生耐药性，例如减少药物摄取、增强药物外排、改变药物靶点等。
细胞培养与药物处理
细胞培养
将肿瘤细胞在特定的培养液中培养，以维持其生长和分裂。
药物处理
根据实验设计，将肿瘤细胞分为不同的药物处理组，加入不同浓度的药物。
胶滴生成与检测
胶滴生成
利用生物材料或聚合物等物质，将肿瘤细胞与药物包裹成胶滴。
检测方法
采用流式细胞术、荧光显微镜等技术，对胶滴进行定量和定性检测。

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集落形成法（HTCA）
四唑蓝比色法 (MTT)
细胞毒性差异染色法 (DiSC)
胸腺嘧啶核苷掺入法 (3HTdR)
原代瘤细胞培养药敏检测方法的几点提示

本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再作为独立的药敏检测方法。
20 0
ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0016
传统化疗(n = 17)
传统化疗(n = 17)
0 50 100 150 200 250
100
150
200
250
Weeks
Weeks
引自Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 1998, 9: 51-57
ATP-TCA 药物测试方式
实验过程

实体瘤（也可以是穿刺样品或腹水等液体样品）先被切碎，并用酶分离成细胞悬液。这一过程并不影响肿瘤细胞的活性。将细胞悬液加入到含有浓度不同的化疗药物的无血清培养基（CAM）中，在培养基板中培养3-5天。CAM培养基可以抑制非瘤细胞的生长，选择性培养肿瘤细胞。培养后，加入可以稳定细胞内ATP的提取试剂，提取出ATP。加入荧光素-荧光素酶系统，在板式发光分析仪上进行ATP的检测。根据含药孔的荧光值与无药孔（M0）的荧光值的比较，得出该浓度化疗药物对肿瘤细胞的抑制值。做出化疗药物的剂量-抑制曲线，得到AUC值、IC90、IC50以及敏感度指数SI值，判断化疗药物的敏感度。
Incubation for 3-5 days
ATPLuminescence
Construction of dose-response plots
Software Evaluation
国内外研究历史回顾
1. 1982年，Moyer等首先提出内源性ATP的含量可以反映细胞活性;随后Kangas 等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性的检测方法。 2. 自1988年，Sevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。

（四）瘤细胞连续培养

瘤细胞培养一定时间后（通常为1～4周），细胞生长增殖达到一定密度，产生密度抑制。故需分离出一部分细胞，进行传代培养，并可建立细胞株。本法得到的瘤细胞数量多，在抗癌新药筛选中起重要作用。缺点是实验周期长，只能作回顾性药敏检测。

二、体内药敏检测

即异种移植法。通常用啮齿类动物做移植宿主。将人癌标本移植于受试动物体内如肾包膜下移植法（SRCA），再给予抗癌药。数天至数周后处死动物，测量移植瘤的大小变化，以评定药物敏感度。本法较体外试验更接近人体情况，对需要体内代谢而发挥作用的药物，如临床常用的环磷酰胺尤为适宜。还可测试联合化疗方案的疗效，临床意义较大。体外试验与体内试验可交替应用。如将体外培养的瘤细胞植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作HCTA培养均可。
Tumor Chemosensitivity Assay
肿瘤体外药敏检测技术进展及应用
广西医科大学外科实验室苏承武
☆ 肿瘤化疗药物敏感性试验是个体化治疗的基础

肿瘤化疗药物敏感性试验(TCA)
Tumor Chemosensitivity Assay
将肿瘤细胞进行体外的有药培养，然后通过检测细胞活性的有关指标，判断不同药物的疗效。通过这种试验，即可确定针对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物或药物组合。
药敏检测方法存在问题
标本可评价率低，仅有40~70％。实验周期长，需要2周以上测试药物种类和数量有限操作繁琐，难以标准化阳性预测值较低，仅有40～60％敏感性较差，最低仅能检测500个细胞量程较小，有效量程在2.0以内可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤人为判断因素较大，难以推广标本可评价率不高，仅有70～80％阳性预测值较低，仅有70～80％实验人员接触放射，不利于健康标本可评价率不高，仅有70～80％测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞对某些药物的测试结果存在假阴性
3. 1998 年，Kurbacher 等人报道了 ATP-TCA 辅助化疗与传统化疗比较的临床Ⅱ期试验结果，试验结果表明， ATP-TCA 指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。 4. NIH 的 GOG (Gynecologic Oncology Group) 项目组认为 ATP-TCA 是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目 (1998)。

☆ 几种原代瘤细胞培养药敏检测方法简介
一、MTT比色法
四氮唑化合物MTT（Methylthiazolyl tetrazolium）在活细胞线粒体酶作用下可裂解为紫蓝色不溶性的甲臜化合物（Formazan），加入异丙醇或二甲基亚砜后，用分光光度计（酶标仪）测出其光密度变化。本法简单迅速，操作可半自动化。缺点是不能区分正常细胞与肿瘤细胞，此外对于不同类型的肿瘤标本可能需要不同的细胞浓度与药物作用时间。故有待进一步改进。目前已有药物梯度浓度的引入。

ห้องสมุดไป่ตู้

一、体外药敏检测
理想的药敏检测方法应该具备的条件
1. 操作简便，可以标准化，便于推广 2. 标本可评价率高 3. 检测敏感、可靠、客观 4. 临床相关性
肿瘤化疗药敏方法发展创新方向
1. 标准化，精确定量（无论是用药量或细胞数等）
2. 对体内环境的极近模拟
（一）瘤细胞直接损害试验
新鲜肿瘤标本制成单细胞悬液，与抗癌药接触 1～数小时后，洗去抗癌药，加入染色剂，与未加药对照样本比较，可从瘤细胞的杀伤比例判断药物抗肿瘤效应。根据染色剂与观察指标的不同，可分为：美兰法、伊红台盼蓝法、吖啶橙荧光测定法、同位素释放法等。上述试验周期短、成本低、方法简便，但准确性差，现已少用或仅作为细胞存活与否的判断方法。
培养前后细胞组成变化
培养前细胞组成 3-5天培养后细胞组成
淋巴细胞
40-50%
上皮细胞
成纤维细胞
肿瘤细胞
10-20%
淋巴细胞
<1%
上皮细胞
<10%
成纤维细胞
<10%
肿瘤细胞
>80%
10-25% 5-10%
选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良好的选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要
ATP-TCA技术的核心试剂

◎. 荧光酶试剂(luciferin-luciferase counting reagent)
热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可靠性，满足
临床实际工作的需要

◎. 培养基(complete assay medium)
肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性
物对肿瘤细胞的杀伤效果。
荧光强度与活细胞数量的关系
10000000
1000000
È (RLU) ¿ ¶ â Ç « ¹ Ó
100000
r£ ½ 0.9986
10000
1000
100
80 15 8 31 2 62 5 12 50 25 00 50 00 10 00 0 20 00 0 40 00 0 80 00 0 10 20 40
传统化疗和ATP-TCA指导的化疗的生存率比较
100 80 100 80 ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0009
Overall Survival
% Patients
Progression free Survival
% Patients
60 40 20 0 0 50
60
40
¸ ° Ï û Ê ý Á ¿ (¸ ö /¿ ×£ ©
技术流程
Tumor
Mechanical and enzymatical dissociation Addition of drugs/medium
Single Cell suspension
ATP extraction and stabilization
目前先进国家对该技术的评价
1. 1998 年德国 DCS 公司将该技术产业化，并获得国际 ISO 质量评估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入。 2. 2001 年，美国全国医疗保险协会 (Health Maintenance Organization) 认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医生选择用药的先进技术，建议在全美进行医疗保险赔付。目前在加州等15个州已获医疗保险赔付。 3. 2003 年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项先进

（二）原代瘤细胞培养

体外药敏预测一般采用短期原代培养。在无菌条件下，用机械法和／或酶消化法，将新鲜肿瘤标本分离为组织块、细胞团或分散的单个细胞（视瘤组织多寡及所用培养方法而定），与各种抗癌药分别作用一定时间后，与对照组比较，可计算用药组的瘤细胞杀伤比例，测出抗癌药物敏感度。
主要的原代瘤细胞培养药敏检测方法及其存在的问题
的临床医学项目，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案
更能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付。
ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感可靠，具有极大的临床应用价值

主要试剂仪器
ATP-TCA核心试剂盒（德国DCS）：包括完全分析培养基（CAM）、最大ATP抑制剂、组织消化酶液、ATP提取液、荧光素-荧光素酶（lulu）、ATP标准品、无菌96微孔培养板。自发光分析仪（德国Berthold）、超净工作台