肿瘤体外药敏检测

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肿瘤体外药敏检测

Incubation for 3-5 days
ATPLuminescence
Construction of dose-response plots
Software Evaluation
国内外研究历史回顾
1. 1982年，Moyer等首先提出内源性ATP的含量可以反映细胞活性;随后Kangas 等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性的检测方法。 2. 自1988年，Sevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。
物对肿瘤细胞的杀伤效果。
荧光强度与活细胞数量的关系
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3. 1998 年，Kurbacher 等人报道了 ATP-TCA 辅助化疗与传统化疗比较的临床Ⅱ期试验结果，试验结果表明， ATP-TCA 指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。 4. NIH 的 GOG (Gynecologic Oncology Group) 项目组认为 ATP-TCA 是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目 (1998)。
☆

肿瘤化疗药敏方法发展及简介
化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近 30 年来，虽然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及多重耐药性（MDR）等因素有关。因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。早在上世纪 60 年代已有报告，用卵巢癌组织进行药敏检测，该组病人中位生存期有明显延长。化疗药敏检测已发展成为体外（in vitro）与体内（in vivo）两类，成为“当今癌症研究的主攻课题”之一。

ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术在治疗非小细胞肺癌胸水中的临床应用

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－０１３５－０４［收稿日期］　２０１１－０９－０７［基金项目］　吉林省长春市科技局科技计划项目资助课题（０８ＳＦ４８）［作者简介］　王　静（１９７６－），女，山东省新泰市人，主治医师，医学博士，主要从事慢性阻塞性肺病发病机制的研究。

［通信作者］　谭　平（Ｔｅｌ：０４３１－８４９９５８６０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｐｉｎｇ＿ｊｄ＠１２６．ｃｏｍ）ＡＴＰ生物荧光肿瘤体外药敏检测技术在治疗非小细胞肺癌胸水中的临床应用王　静，赵建军，李运霞，谭　平，徐珊珊（吉林大学中日联谊医院呼吸科，吉林长春１３００３３）［摘　要］　目的：研究三磷酸腺苷－生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ＡＴＰ－ＴＣＡ）在非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）化疗中的应用，为临床治疗方案的选择提供依据。

方法：选择５２例伴有胸水的ＮＳＣＬＣ患者，根据患者及家属治疗意愿分为经验治疗组和药敏治疗组。

经验治疗组２０例患者根据经验给予（紫杉醇联合卡铂，ＰＴＸ＋ＣＢＰ）标准方案全身化疗；药敏治疗组３２例患者对胸水标本分别进行顺铂（ＤＤＰ）、诺维本（ＮＶＢ）、紫杉醇（ＰＴＸ）、卡铂（ＣＢＰ）、健择（ＧＥＭ）、ＰＴＸ＋ＣＢＰ、ＮＶＢ＋ＣＢＰ、ＧＥＭ＋ＤＤＰ体外药敏检测，根据体外药敏检测结果选用化疗方案，比较２组患者治疗有效率。

结果：体外药敏试验，单一用药中ＮＶＢ和ＰＴＸ对ＮＳＣＬＣ的体外敏感率最高，均为２８．１％；ＧＥＭ的体外敏感率次之，为２５％；ＣＢＰ的体外敏感率为２１．９％；ＤＤＰ的体外敏感率最低，为１７．６％。

联合用药方案显示较好的治疗效果，其中ＧＥＭ＋ＤＤＰ的体外敏感率最高，达５５．９％；ＰＴＸ＋ＣＢＰ的体外敏感率次之，达５０％；ＮＶＢ＋ＣＢＰ的体外敏感率最低，为４０．６％。

药敏治疗组患者有效率为６５．６％，经验治疗组有效率为４０．０％，两组有效率比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

结论：不同化疗药物对ＮＳＣＬＣ的体外敏感率不同；根据药敏试验结果选择化疗方案可取得更好的临床治疗效果。

肿瘤药敏检测技术

靶向药的靶向机制决定了基因检测的必要性和临床意义
基因检测指导靶向用药结果不理想下可作为备选方案
日本进入医保中国临床应用较多
用药指南未规定临床应用较少
国外伴随诊断市场快速增长；进入用药指南和医保
用药指南未规定
2
一、药敏检测技术需求分析
➢ 临床需求——精准医疗下肿瘤用药指导：药物敏感性、耐药性、副作用等
13
二、药敏检测技术路线
• 2D细胞模型——ATP-TCA生物荧光药敏检测
荧光素酶改造 • 改造目标：提高灵敏度、稳定性 • 改造流程可如下所示：
合成北美萤火虫荧光素酶基因
设计点突变引物，定向突变荧光酶潜在的多个活性相关位点
通过蛋白工作站，纯化生产重组荧光酶
筛选得到灵敏度和稳定性高的克隆
四唑蓝比色法 (MTT)
简便、快捷、费用低
敏感性较差，最低仅能检测500个细胞；量程较小，有效量程在2.0以内。
ATP生物荧光法
敏感性好（可检测最少10个细胞）、可评价率高、快速检测、
精密度好、具备产业化条件
——
野生型荧光素酶通常稳定性较低，如在体外 37℃放置3分钟即失活。
海创生物的ATP-TCA技术核心： 1、化学结构改良的ATP荧光素酶，稳定表达荧光强度 2、肿瘤选择性培养基
微镜对胶滴中细胞的染色情况进行扫描，通过图像软件设定
亮度阈值，排除染色较浅的成纤维细胞, 计算肿瘤细胞形成
清除血细胞、死细胞、的克隆的OD值，计算出药物的抑制率。
非细胞杂质
实例2：使用达瑞生物的DR6690进行图像采集和分析
收集活细胞重新分散后与胶原凝胶混合，制成胶滴
胶滴培养一定时间
胶原可外购，如 Sigma、Fluka的I型胶原蛋白

肿瘤体外药敏试验与临床实用研究进展

性和化疗的疗效。ＡＰ— ＣＴＴＡ是通过测定细胞内源性ＡＰ的含量从而反Ｔ
映化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力，在肿瘤细胞数量很少的时候也能检测到较高数值，有高敏感性、具技术检测结果与体内治疗反应具有高度的一致性。成为除ＭＴ法之外在临１ｒ床上也较多用的肿瘤体外药敏试验方法，已被制成试剂盒并在国外应用较多］Ｔ。ＡＰ是活细胞的基本能量单位，当细胞的代谢受损时，ＴＡＰ合成下降，细胞死亡时受酶的作用ＡＰＴ迅速水解消失，ＴＡＰ水平与活细胞数量呈正相关，故通过测定其水平可反映生物体的增殖活性。ＡＰ体外药敏试验的Ｔ原理是细胞内ＡＰ与荧光素酶复合物作用产生可测定荧光，Ｔ检测荧光值计算出ＡＰ量可反映活细胞数。１８Ｔ９８年Ｓｖｎ等选择２ｅｉ４孔培养板，采用软琼脂半固相底层与液相上层为基础的双层培养法，２将２例卵巢癌细胞在体外与不同化疗药物培养５天一７天，ｆ缓冲液中和后加入ＡＰ抽ｒｓｉＴ提液，置于发光仪中计数，ＡＰ荧光值下降的比值来判断据Ｔ其对化疗药物的敏感性，出该试验方法敏感性为８．％，得９５特异性为１０，性预测值为１００，性预测值０％阳０．％阴为６．％。多数研究认为，６７对乳腺癌手术后组织的可评价率
技术；９０年Ｋｒ１９ｅｎ和Ｗｅｓｎｈ临床试验表明体外药敏试ｉｔａｅｌ验可用来预测病人对药物的治疗反应；９３年Ｆｕｈｕ１９ｒｅａｆ和Ｂｓｑｅ临床试验表明肿瘤体外药敏试验的结果和患者生ｏａｕｔｎ存率有显著关系；００年在国外一些国家抗癌药物敏感性试２０验进入了医疗保险；０１年Ｋｒａｈｒ道肿瘤体外药敏试２０ｕｂｃｅ报验指导下的化疗可能改善患者的预后。

TCA技术原理

TCA：
ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测技术是近年来发展起来的最先进的肿瘤药敏检测技术，已在欧美和日本等国家进行了大量的临床应用研究，临床试验证实该技术的应用提高了肿瘤的疗效。

美国国立卫生研究院的GOG(Gynecologic Oncology Group)项目组认为ATP-生物荧光体外检测肿瘤化疗敏感性方法是最有发展前途的一种药敏试验方法。

技术原理：
根据细胞内源性ATP含量与活细胞数呈正相关，因此，测定细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞数量。

在体外测定经不同浓度化疗药物直接杀伤的培养肿瘤细胞中的ATP含量，进而判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。

具体做法：
选取手术切除的新鲜组织标本，经组织消化酶将组织块消化成单个细胞，接种至加有不同浓度化疗药物的96孔板内，经过培养，检测ATP的含量，从而计算肿瘤细胞的抑制率，判断药物的敏感程度。

该技术能在患者化疗之前检测出该患者肿瘤细胞对药物的敏感性，准确预见体内治疗效果，从而为患者筛选出相对有效化疗药物，为临床医师确定化疗方案和开展有的放矢的个体化治疗提供科学依据。

其良好的稳定性和重复性、高敏感性、高可评价率、高通量筛选、计算机扫描和软件分析等特点，使该技术体外检测结果与体内治疗反应间具有高度的一致性，其总的预测准确率在85%以上，阳性和阴性预测值、敏感性和特异性均高于其他技术。

消化道肿瘤体外化疗药物敏感性与临床特征的相关性

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００）ｏｃｕｉｎＴｅｉｉｏｔｍｏｕｃｐｉｉｔｔｓｎａｅｅｍｉｅｔｅｓｎｉｖｔｏｕｒｔｓｅｔａｉｕ．５．Ｃｎｌｓｈｎｖｔｕｒｓｓｅｔｌｙｅｔｇｃｎｄｔｒｎｈｅｓｉｙｆｔｍ０ｉｕ０ｖｒｓｏｒｂｉｉｔｉｓ０
率为８．％，小抑制率为４４平均抑制率为３．％；Ｄ１２最－％，５６ＤＰ最大抑制率为５．，小抑制率为０，均抑制率为８７最％平
３．％。各药物的敏感性与肿瘤分期无相关性（１２Ｐ＞００）结论体外肿瘤药敏试验可以判定各化疗药对肿瘤组织．５。
ｔｏｎｔｓｉｌｔｏｓｒｉｅｔｎａｕｍｒ
ＨＡＮｎｕＹｕｇｏ
ＤｅａｔｎｆＰａｍａｙｔｅＣｅｔｌＨｏｐｔｌｏｉｚｏｔ，ＳａｄｎｒｖｎｅＢｉｚｏ２７０ｈｎｐｒｍｅｔｏｈｒｃ，ｈｎｒｓｉｆＢｎｈｕＣｉａａｙｈｎｏｇＰｏｉｃ，ｎ感性，为临床标准化化疗用药及个体化化疗提供依据，可对消化道肿瘤的辅助化疗有一定帮助。
【键词】消化道肿瘤；外药敏试验；裂霉素；一氟脲嘧啶；关体丝５顺铂
【中图分类号】７５Ｒ３
【献标识码】文Ａ
ｓｅｉｎｎ３ａｉｎｓｗｉｄａｃｄｇｓｒｉｔｓｉａａｃｒｗｅｅｄｔｃｅｔｐｃｍｅｓｉ０ｐｔｔｔａｖｎｅａｔｏｎｅｔｌｃｎｅｒｅｅｔｄｗｉＭＴＩｓａ．ｎｈｏｒｌｔｎｂｔｅｅｈｎｈ＂ａｓｙａｄｔｅｃｒｅａｉｅｗｅｎｏｉｈｂｔｎｒｔｓａｄｃｉｉａｔｇｓｗａｘｌｒｄｎｉｉｉａｅｎｌｃｌｓａｅｓｅｐｏｅ．ＲｅｕｔＭＣｍａｉｍｎｉｉｉｎｒｔｓ８．％ａｄｍｉｉｍｎｉｉｏｎｓｌｓＭｘｍｕｉｈｂｔａｅｗａ５５ｏｎｎｍｕｉｈｂ．ｔｎｒｔｓ６３，ｔｎａｅａｅｉｈｂｔｎｒｔｆ４．％；一Ｆｘｍｕｉｈｂｔｏａｅｗａ１２ａｄｍｉｉｍｎｉａｅｗａ．％ｗｉｈａｖｒｇｎｉｉｏａｅｏ２２ｏｉ５ｕｍａｉｍｎｉｉｎｒｔｓ８．％ｎｎｍｕｉ．ｉｈｂｔｎｒｔｓ４４，ｗｉｎａｅａｅｉｈｂｔｏａｅｏ５６；ｉｉｏａｅｗａ．％ｉｔａｖｒｇｎｉｉｎｒｔｆ３．％ＤＤＰｍａｉｍｎｉｉｏａｅｗａ．％ａｄｍｉｉｍｈｉｘｍｕｉｈｂｔｎｒｔｓ５８７ｉｎｎｍｕｉｈｂｔｏａｅｗａ，ｔａｖｒｇｎｉｉｏａｅｗａ２．Ｄｒｇｓｓｅｔｂｌｙａｄｔｍｏｔｇｒｏｅａｅｎｉｉｎｒｔｓ０ｗｉｎａｅａｅｉｈｂｔｎｒｔｓ３．％ｉｈｉ１ｕｕｃｐｉｉｉｎｕｒｓａｅｗｅｅｎｔｒｌｔｄｔ

肿瘤患者体外药敏试验的研究进展

Ｅｓｈｒｈａｃｌ．ｅｄｉｔｅ，９４，２１）４６～４３ｃｅｉｉｏｉＴｒｎｓＢｏｅｈ１９１（１：５ｃ６
４ＢｌＣ，ＣａＫ，Ｒｅｅ。ｅ１．ｏｏｓｋｎｓｅｐｅｓｏｉｍｅｈｅｖｓＰＪｔａＲｈｄｐｉｎｉａｅ：ｘｒｓｉｎｎ
７郑立运，先珍．方酵母表达系统最新研究进展．州牧业工程高等郑
８前景与展望
８
专科学校学报．０５源自（）２０５２０，５４：５ —２３
ｎ，ｏｎａＳＢ，ａｎｎＭ，ｔａ．ｃｖｒｏｌｅｄｓａｉｈＬＮｍｈＦｎｏｅ１Ｒｅｏｅｙｏｍｌｆ￣ｎｏｔｔｎｐｏｕｅｙＰｃｉａｔｒｓｇｅｐｎｅｅｄｏｐｉｎ．ｉｓｐｍｔｎｒｄｃｄｂｉｈａｐｏｉｕｉｘａｄｂｄａｓｒｔｓｓｎｄｏＢｏｅａｉ，ｏ
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第１期
农垦医学
第３０卷
由此，ｐ表达系统可作为研究膜蛋白结构和功能的Ｐ场所。Ｐｐ表达外源蛋白既可以在胞内表达，可以也分泌到胞外。对于胞内表达，往使用Ｍｔ往ｕ一表型菌株，降低ＡＸ的表达，利于外源蛋白的纯化；Ｏ有对于分泌表达，几种甲醇利用表型都可以使用。
ｍｅｈｌｔｐｉｙａｔ．ｒｉｉｔｃｎｌ１９８５）５４～５０ｔｙｏｒｈｅｅｓｓＣｕｔＯｐｎＢｏｅｈｏ，９７，（：５ｏ６

浅谈肿瘤化疗药敏试验方法

关键词：抗癌药；药敏试验；检测；肿瘤
如何更有效地筛选应用抗肿瘤药物，预测个体肿瘤对药物的敏性的判断方法是，利用图像分析装置，依据肿瘤细胞和成纤维细胞的感Ｊ生，指导临床治疗以提高疗效早已成为临床化疗界瞩目的问题。近增殖形态和中性红染色程度的差异计算出肿瘤细胞克隆的体积值，进年来，肿瘤药敏试验指导的个体化治疗的研究，受到国内外肿瘤界的而计算出抗肿瘤药物处理组（Ｔ）和非处理组（ｃ）之间的相对增殖率之重视。国际上，相继建立了一系列药物敏感Ｉ生试验技术。应用人类新鲜比（即值）。Ｔ／ｃ值在５０％以下的被认为肿瘤对该试验药是敏感的。
【技术原理】【技术原理】基于以整体细胞群杀灭概念为基础，同时检测分裂细胞和非分ＡＴＰ生物荧光技术产生于２０世纪７０年代中期。１９８３年，Ｍｏｙｅｉ一裂细胞，从而维持肿瘤细胞群体的异质眭。因为肿瘤难治的主要原因等提出内源性三磷腺苷的数量可以反映细胞的活性度。随后，Ｋａｒｃｍ是其与肿瘤细胞群体中有可逆的非分裂细胞（即Ｇｏ期细胞）的杀灭
２四氮唑（ＭＴＴ）比色法
பைடு நூலகம்
【技术原理】活细胞特别是增殖期细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶将黄色的Ｍ１代谢产物５一氟一２一脱氧尿苷＿５ — 磷酸和ＤＮＡ合成形成牢固立体的共代谢为深蓝色的甲躜晶体，ＦＧＦ二甲基亚砜ＤＭＳＯ溶解晶体后，价复合物，而阻滞ＤＮＡ合成；另外，５＿Ｆｕ最终被ＤＰＤ等三种分解为５７０ｎｍ波长测量Ａ值并判断结果。近年来，ＭｒＩＴＩ１法在几乎所有类型肿氟一Ｂ一丙氨酸而排泄，ＤＰＤ活性和５一Ｆｕ抗肿瘤效果呈负相关。瘤药敏试验中应用，其可评率高、简易快速、观察终点客观。ＭｑＴ法也【技术特点】有多种改良，如用软琼脂培养，减少正常细胞生长；于ＭＴｒ溶液中加通过检测肿瘤组织内ＴＳ、ＤＰＤ潘陆可预测对５－Ｆｕ的敏感性，进步以ＲＴ－ＰＣＲ等分子生物学技术检测内镜下获得的微量组织标本【技术特点】中ＴＳ、ＤＰＤ的ｍＲＮＡ表达情况，可由于肿瘤的恶性性质及目前肿瘤Ｍ１Ｔｒ法有众多优点，被认为是简便、快捷、经济的药敏方法。治疗的现状，医师和患者均希望有能够准确预测化疗药物敏感『生的方３胶原凝胶包埋培养药物敏感・眭实验法，能否与临床实际相符合是医师考虑的首要因素，价格、操作难易程【技术原理】度、需要的时间也在考虑范围之内。随着人们对药敏试验的不断重视，是先通过特定的酶消化９中瘤细胞外基质，单纯回收细胞成分，再以及方法上的不断改良，或出现了新的药敏测试方法，从而能进一步将这些细胞成分包埋于人工的细胞外基质，即Ｉ型胶原凝胶中，以此提高肿瘤化疗效果，改善患者的预后。在这种情况下，开发对肿瘤敏感构成—个与体内相似的微环境，并将它们放置于近似于体内的环境中药物的新筛选方法，从不断增多的各种治疗方案中选择对患者最合适进行三维立体培养，然后进行药敏试验。ＣＤ－ＤＳＴ的药物抗肿瘤敏感的抗肿瘤药越来越重要，已成为临床化疗界瞩目的重要问题之一。

肿瘤体外药敏检测

集落形成法（HTCA）
四唑蓝比色法 (MTT)
细胞毒性差异染色法 (DiSC)
胸腺嘧啶核苷掺入法 (3HTdR)
原代瘤细胞培养药敏检测方法的几点提示

本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再作为独立的药敏检测方法。
物对肿瘤细胞的杀伤效果。
荧光强度与活细胞数量的关系
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技术流程
Tumor
Mechanical and enzymatical dissociation Addition of drugs/medium
Single Cell suspension
ATP extraction and stabilization

体外试验与体内试验可交替应用。如将体外培养的瘤细胞植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作HCTA培养均可。
☆ 几种原代瘤细胞培养药敏检测方法简介
一、MTT比色法
四氮唑化合物MTT（Methylthiazolyl tetrazolium）在活细胞线粒体酶作用下可裂解为紫蓝色不溶性的甲臜化合物（Formazan），加入异丙醇或二甲基亚砜后，用分光光度计（酶标仪）测出其光密度变化。本法简单迅速，操作可半自动化。缺点是不能区分正常细胞与肿瘤细胞，此外对于不同类型的肿瘤标本可能需要不同的细胞浓度与药物作用时间。故有待进一步改进。目前已有药物梯度浓度的引入。

体外肿瘤药敏试验对原发性肝癌个体化化疗的应用价值分析

９６
北方药学２０１４年第１１卷第３期
用是胃肠道反应，若不能耐受可改为绿吡格雷作为替代治疗。该药起效快，顿服３００ｍｇ后２小时血药浓度可达有效治疗浓度，维持剂量为每天７５ｍｇ。Ｂ一受体阻滞剂一般从小剂量开始，逐渐递２．２．１有缺血性胸痛症状。使息状态下心率维持在５５－－６０￣，／ｍｉｎ，研究表明美托洛尔可２．２．２新出现或很可能新出现ｓＴ段显著抬高／Ｉ１波改变或新出增，显著降低心肌梗死患者急性期和心肌梗死后的死亡率，若长期现左束支传导阻滞。２．２．３心电罔出现新的病理性Ｑ波。服用可使心源猝死降低４０％。在慢性稳定型心绞痛患者中，若心力衰竭或左室收缩功能不全，应首选转换酶抑制２．２．４有新现的存活心肌丧失或新出现局部室壁运动异常的合并糖尿病、剂（ＡｃＥＩ）恤管紧张素 Ⅱ受体拈抗剂。②改善症状的药物：常用的影像学证据。有Ｂ一受体阻滞剂，硝酸酯类、钙拈抗剂，硝酸酯类药物能减少心２．２．５血管造影或尸检发现冠状动脉内血栓。２．３急性冠脉综合症的药物治疗： ①改善预后的药物：目前常用肌的耗氧量和改善心肌的灌注，但会反射性使心率加快，故应一受体阻滞剂或非二氢吡啶类钙拈抗剂药物联合使用。另外的有他汀类、阿司林、绿吡格雷、Ｂ～受体阻滞剂、转换酶抑制与Ｂ每天用药应给予足够的无药期，以减少耐药性的发生。剂（ＡＣＥＩ）／血管紧张素 Ⅱ受体拈抗￣｝Ｉ（ＡＲＢ）。他汀类以瑞舒伐他汀效果最好，每天若服用８０ｍｇ，血脂降幅可达５８％，若不出现严参考文献１ＩＮ玉杰，汤楚中．冠心病规范化治疗【Ｍ用。所以急性冠脉综合症患者只要没有【２００９．药物禁忌症都应服用，每天最佳剂量范围７５～１５０ｍｇ，主要副作出版社。

实体肿瘤体外药敏技术研究进展及其临床应用研究

感试验打下了基础。ＨＣＡ法是在含有化疗药物的Ｔ
１２２四唑蓝比色法（Ｔ法）ＭＩ方法是利用．．Ｍ１ｒ：ｒＴ
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将可溶性的四氮唑盐还原为不溶的蓝紫色沉淀物甲潜产生颜色反应的原理，通过体外细胞培养中的线粒体琥珀酸脱
一
将肿瘤细胞直接浸入化疗药物中，短期培养４天，然
后再采用坚固绿或坚固绿一苯胺黑染料进行染色，可
将死亡或濒临死亡的细胞染成亮绿色，活细胞则而拒染。通过在显微镜下计算被杀死的肿瘤细胞比率，反应化疗药物的效果。该方法不需要单细胞悬液，不依赖细胞的分裂。Ｇｚａ、ｌｕ等进行了该方面的ａｄｒＷｉｒｂ研究，结果显示该技术评价成功率为３％一８＇，３７％５Ｊ６但疗效结果的差异较大。该方法需要具有丰富的细胞学经验，易受人为因素影响，目前还缺乏随机对照
瘤细胞的代谢和ｐＨ值的影响，测结果与临床疗检效符合率不理想，不少学者在探讨对此技术的改良。
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・
４・０
中国小儿血液与肿瘤杂志２００８年２月第１３卷第１期
ＪＣｉａＰｄａｌｏａｃｒＦｂｕｒ０８Ｖｌ３Ｎ．ｈｎｅｉｒＢｏｄＣｎｅ，ｅｒａｙ０，ｏ１，ｏ１ｔ２
・
综
述・
培养条件下，察细咆分裂、观克隆形成的一种方法。

非小细胞肺癌的体外药敏实验及其临床价值的开题报告

非小细胞肺癌的体外药敏实验及其临床价值的开题报告一、选题背景和意义肺癌是全球范围内最常见的癌症之一，也是癌症致死的主要原因之一。

根据WHO的统计数据，全球每年约有180万人死于肺癌，其中非小细胞肺癌占大多数。

非小细胞肺癌由于易转移、难治疗等特点，其5年生存率仅为15%左右，治疗难度极大。

因此，寻找新的、针对该疾病的治疗方法是非常必要的。

针对非小细胞肺癌的治疗方法目前主要包括手术、化疗等综合治疗手段，其疗效和耐受性存在很大差异。

因此，选择更加有效、低毒副作用的治疗方法成为非常必要的要求。

体外药敏实验通常被视为一种预测肿瘤治疗反应的方法。

该实验可以用来评估候选抗癌药物的毒性和有效性，以指导临床治疗。

具体而言，该实验可以通过研究抗癌药物与肿瘤细胞的作用机制，确定肿瘤对某些药物的敏感性，从而为肺癌的治疗提供参考。

因此，非小细胞肺癌的体外药敏实验具有重要的临床意义，可以为肺癌的治疗提供较好的理论和实践指导。

二、研究目的和内容本研究旨在通过体外药敏实验，研究非小细胞肺癌对不同抗癌药物的敏感性，并探讨其临床价值。

具体而言，本研究将开展以下内容：1. 收集非小细胞肺癌患者的肿瘤样本，制备肺癌细胞株及对照细胞株；2. 筛选抗癌药物，包括常用的化疗药物、靶向药物等；3. 建立体外药敏实验模型，通过细胞增殖实验、细胞毒性实验等方法，评估不同药物对肺癌细胞的生长和存活影响；4. 统计、分析实验结果，研究药物对肺癌细胞的作用机制及其对肿瘤治疗的潜在临床意义。

三、研究意义和预期成果本研究将选择多种不同的抗癌药物，通过体外药敏实验，对非小细胞肺癌细胞的敏感性进行测试，可以为肺癌治疗提供新的治疗途径和治疗策略。

同时，本研究还可以进一步提高人们对于肺癌治疗的认识和理解，增加肺癌患者和家属的治疗信心，提高非小细胞肺癌治疗的疗效。

预期成果包括，研究不同抗癌药物对非小细胞肺癌细胞的作用机制，探讨其在肿瘤治疗中的潜在临床意义；研究新型、低毒副作用的药物增加非小细胞肺癌治疗手段等。

应用MTT法进行体外抗肿瘤药敏试验影响因素研究

华北国防医药２０年１月第２卷第６０８２０期ＭｄａＪｕａｏＮｔｎｅｎｉｏｅｉＮＡｈｎ，ｅ．０，ｏ２，ｏｅｉｌｏｒｌｆａｏａＤｆｄｇＦｒｓｎｏｈＣｉＤｃ０８Ｖ１０Ｎ．ｃｎｉｌｅｎｃａ２．６
ｈｍａｅｉｈｒｌｂｏｄｍＩｏｕｌａｅｌＰｕｎｐｒｅａｌｏｌｎｃｅｒｌｐｎｃｓ（ＢＭＣ）ｔｎｉａｃｒｄｕｓＯｘｌｌｔｎａｌａｅｎｈｉｆｅｅｔｅｃｌｒｎＴｏａｔｃｎｅｒｇａｉａｉａｄＰｃｉｘｌａｄｔｅｔ－ｐｎｔｍｅｏｌｃｉｕｔｅａｄＭＴｓｖｕ
ＷＥＩｎｑｎ，ＨＡＯＭａ —ａｇＬＵＪｎＪＡＯＪａ，ＨＡＮＧＹａＦｏ，ｉｇ（ｅａｔｎｆＣｎｒｌＬｂｒｔｒ，ｅｅａＨｏｐｔｌＷｅ —ｉｇＺｎｃｎ，Ｉｉｇ，ＩｕｎＺｎ，ＵＹａＡＮＰｎＤｐｒｍｅｔｏｅｔａｏａｏｙＧｎｒｌｓｉａａｏｅｊｇＭｉｔｒｅｏｆＢｉｎｌａｙＡｒａＣｍｍａｄ，ｉｎ０７０，ｈｎ）ｉｉｎＢｅｉｇ１００Ｃｉａｊ
［ｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｓｂｉｔｄｒｐｏｅｓｆａｕｉｇｈｎｉａｃｒｒｇｓｎｉｖｙｉＴａｓｙｙａａｚｇｔｆ — Ａｓｃ］ｒｊｃｖ：ｏｅｔｌｈａｓｎａｒｃｓｏｍｅｓｒｅａｔｃｎｅｄｕｓｉｔｗｔＭＴｓａｎｌｉｅｉｕｉａｓａｄｎｔ — ｅｔｉｈｂｙｎｈｎｌ
－

ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测方法的应用探讨

较高的临床符合率。结论：开展ＡＴＰ一生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测对临床治疗用药具有重要的指导意义。
【关键词】
肿瘤细胞；药物敏感试验；可行性【文献标志码】Ａ【文章编号】１００７ — ８５１７（２０１３）２３ — ００２８ — ０３
中国民族民间医药
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学术探讨
Ａｃａｄｅｍｉｃｓｔｕｄｙ
２８・
Ｃｈｉｎｅｓｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｅｔｈｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄｅｔｈｎｏｐｈａｎｎａｃｙ
【中图分类号】Ｒ９６９．３
化学治疗是治疗恶性肿瘤的三大治疗手段之一，由于
肿瘤患者存在个体差异及肿瘤的异质性，肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异ｌ２，特别是肿瘤复发和经过多
次化疗的患者。因化疗前缺乏患者对化疗药物敏感性和耐药性的直接检测证据，在制定化疗方案时不可避免地存在
～
１．２化疗药物化疗药物为１００％药物血浆峰值浓度（１００％
ＰＰＣ）（见表１）。联合用药的每个药物的浓度与单药浓度相同。
表１化疗药物及剂量
４Ｘ１０６个／ｍｌ备用。
１．４．３加待测药物于９６孔培养板，每个药物设１００％、５０％、２５％、１２．５％和６．２５％ＰＰＣ５个浓度，每个浓度２个平行孔，并设无药对照组（ＭＯ），和最大抑制对照组（ＭＩ）。接种所得肿瘤细胞，细胞数为２Ｘ１０４个／孔。在３７ ℃ ，５％ＣＯ：条件下培养５ｄ后，开始测定。最大抑制对照孔加５０ｌ最大抑制剂，其余各孔加５０￣ＩＡＴＰ提取液，在震荡器上震荡３０ｓ，室温静置５ｍｉｎ。再次震荡？昆匀。每孔取５０ｌｘｌ液体，按相应的位置加到荧光测试板内，每孔加入

肿瘤组织块体外药敏试验在肺癌化疗中的应用

【ｅｏｄ】Ｌｎｎｅ；ＥｔｅｏｎｉｉｓＫｙｒｗｓｕｇａｃｃｒｘｉｏｈｍｓｓｖｙａｖｒｃｅｔｔａｙｉｓ
化疗是非小细胞肺癌的主要治疗方法之一，但临床抗肿瘤药物治疗的有效率不高…。经验性化疗存在一定盲目性，而通过检测肿瘤对化疗药物的敏感度，以合理联合用药，个体化 ” 可以“ 化疗取代盲目性化疗。许多研究结果显示，可使化疗有效率提高１以上。在认识到肿瘤细胞异型性及细胞间相倍互作用对药敏具有重要影响后，学者开始强调在肿瘤培养中保持肿瘤的异型性、三维立体结构及模拟体内药物与肿瘤作用方式的重要性。我们通过采用肺癌组织块体外药敏试验方法，对常用化疗药物进行筛选，为临床化疗方案的合理选择提供可靠依据。
长春瑞滨２．吉西他滨２．％、７８％、７８足叶乙苷２．丝裂霉素１．％、２２％、６７草酸铂４．％。结论４４肺癌组
织块体外药敏试验可用于肺癌化疗药物的筛选。
【关键词】肺癌；体外药物敏感试验
Ｔｈｐｌａｉｎｏｈｘｖｔｏｔｎｏｉｓｅｃｅｓｎｉｖｔｓａｎｔｅｃｅｏｈｒｐｆｌｎｅａｐｉｔｆｔｅｅｉｕｉｒｔｕｈｍｏｅｓｔｉａｓｙｉｈｈｍｔｅａｙｏｕｇｃｏｒｓｉｙ
２．％．６７ａｄ４．％ｒｓｅｔｅｙＣｏｃｕｉｎＴｅｅｉｏｔｍｏｓｕｈｍｏｅｓｔｉｓｓａ２２１．％ｎ４ｅｐｃｉｌ．ｖｎｌｓｏｈｘｖｔｒｕｒｔｓｅｃｅｓｎｉｖｔａａｉｉｉｙｓｙｃｏｃｒｔｅｓｒｅｉｇｏｅｔｅａｅｔｒｇｇｉｓｌｎａｃｒｈｉｅｆｃｅｎｎｆｈｍｏｈｒｐｕｉｄｕｓａａｎｔｕｇｃｎｅ．ｏｈｃｃ

肿瘤体外药敏实验简介

样，对化疗药物也实施药敏试验而选择有效的抗癌药，不仅可提形态和中性红染色程度的差异计算出肿瘤细胞克隆的体积值，进
Ｔ和非处理组（之间的相对增Ｃ）高疗效，也可避免无效抗癌药给患者带来的毒副作用和经济负而计算出抗肿瘤药物处理组（）
映细胞的活性和活细胞数量。荧光酶在有氧条件下，以和荧光胞即Ｇ可０期细胞的杀灭密切相关。该法利用快绿使短期培养（４素结合后催化ＡＰ转变成Ａ，且释放出荧光（ＴＭＰ并波长为５２ｄ的死细胞着色，６）同时加入鸭红细胞作为内计数标准，以药物处ｎ。肿瘤细胞经体外给药培养后，ｍ）测定其ＡＰ含量，Ｔ与未加药理组与对照组残存肿瘤细胞的比值作为评价药物敏感性的指标，
中期。１８，ｏｅ等提出内源性三磷酸腺苷（Ｔ）９３年ＭｙｒＡＰ的数量可细胞的干扰，只评价抗癌药对癌细胞的影响。使用Ｃ而Ｄ—ＤＴＳ以反映细胞的活性度。随后，ａｍ等相继证实该技术是一种敏法测定的专用试剂盒，Ｋｒｃ同时伴随画像分析装置的简略化、中性红
维普资讯
惦床和实验医学杂志２００７耳８月第６卷
第８期
・１１・３
肿瘤体外药敏实验简介
唐佳英（常州第一人民医院药剂科江苏常州２３０）１０３
目前临床应用的抗癌药多达百余种，如何从中选择给药并非微环境，并将它们放置于近似于体内的环境中进行三维立体培

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1.肿瘤细胞的异质性(heterogeneity)

肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特点，而同一种肿瘤的基因特性和发生阶段都可能会有非常大的差别；表现出在形态上和生物学功能上的极大的不同。这种肿源自细胞的异质性已经得到越来越清楚的认识。
肿瘤细胞的异质性主要表现在形态异质性：病理学上的形态多种多样。基因异质性：肿瘤的发生经历了多基因的改变，同一种基因可以有多个突变位点。如P53基因的突变位点就已发现有 2000个之多。功能异质性：基因的异质性导致生物学功能的异质性。

一些相对简便经济的方法在目前仍应积极提倡，如MTT比色法。
（三）同步瘤细胞培养

将处于不同细胞周期的瘤细胞分离培养，可研究药物的周期特异性作用。
1.药物阻断法如长春新碱使细胞阻滞于M期，博莱霉素则使其堆积于G2期。 2.物理法运用细胞同步化技术，如M期细胞震荡收集法，可避免药物阻断法的干扰作用。
左：肠型腺癌(胃)
右：弥漫型胃癌
2.临床与个体化治疗

化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中具有不可替代的地位。
同种肿瘤对化疗药物具有不同的反应性，忽视个体差异仅凭经验式化疗存在盲目性，使得总体疗效不佳。尤其对实体瘤，经验化疗的疗效仅为20％左右。

临床需要切实可行的检测方法，在用药前筛选出敏感药物，以进行针对性较强的个体化治疗；是否进行个体化治疗成为肿瘤化疗能否成功的关键因素。

（四）瘤细胞连续培养

瘤细胞培养一定时间后（通常为1～4周），细胞生长增殖达到一定密度，产生密度抑制。故需分离出一部分细胞，进行传代培养，并可建立细胞株。本法得到的瘤细胞数量多，在抗癌新药筛选中起重要作用。缺点是实验周期长，只能作回顾性药敏检测。

二、体内药敏检测

即异种移植法。通常用啮齿类动物做移植宿主。将人癌标本移植于受试动物体内如肾包膜下移植法（SRCA），再给予抗癌药。数天至数周后处死动物，测量移植瘤的大小变化，以评定药物敏感度。本法较体外试验更接近人体情况，对需要体内代谢而发挥作用的药物，如临床常用的环磷酰胺尤为适宜。还可测试联合化疗方案的疗效，临床意义较大。体外试验与体内试验可交替应用。如将体外培养的瘤细胞植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作HCTA培养均可。

一、体外药敏检测
理想的药敏检测方法应该具备的条件
1. 操作简便，可以标准化，便于推广 2. 标本可评价率高 3. 检测敏感、可靠、客观 4. 临床相关性
肿瘤化疗药敏方法发展创新方向
1. 标准化，精确定量（无论是用药量或细胞数等）
2. 对体内环境的极近模拟
（一）瘤细胞直接损害试验
新鲜肿瘤标本制成单细胞悬液，与抗癌药接触 1～数小时后，洗去抗癌药，加入染色剂，与未加药对照样本比较，可从瘤细胞的杀伤比例判断药物抗肿瘤效应。根据染色剂与观察指标的不同，可分为：美兰法、伊红台盼蓝法、吖啶橙荧光测定法、同位素释放法等。上述试验周期短、成本低、方法简便，但准确性差，现已少用或仅作为细胞存活与否的判断方法。
药敏检测方法存在问题
标本可评价率低，仅有40~70％。实验周期长，需要2周以上测试药物种类和数量有限操作繁琐，难以标准化阳性预测值较低，仅有40～60％敏感性较差，最低仅能检测500个细胞量程较小，有效量程在2.0以内可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤人为判断因素较大，难以推广标本可评价率不高，仅有70～80％阳性预测值较低，仅有70～80％实验人员接触放射，不利于健康标本可评价率不高，仅有70～80％测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞对某些药物的测试结果存在假阴性
肿瘤体外药敏检测技术进展及应用
☆ 肿瘤化疗药物敏感性试验是个体化治疗的基础

肿瘤化疗药物敏感性试验(TCA)
Tumor Chemosensitivity Assay
将肿瘤细胞进行体外的有药培养，然后通过检测细胞活性的有关指标，判断不同药物的疗效。通过这种试验，即可确定针对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物或药物组合。
传统化疗和ATP-TCA指导的化疗的生存率比较
100 80 100 80 ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0009
Overall Survival
% Patients
Progression free Survival
% Patients
60 40 20 0 0 50
60
40
☆

肿瘤化疗药敏方法发展及简介
化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及多重耐药性（MDR）等因素有关。因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。早在上世纪 60年代已有报告，用卵巢癌组织进行药敏检测，该组病人中位生存期有明显延长。化疗药敏检测已发展成为体外（ in vitro ）与体内（ in vivo ）两类，成为 “当今癌症研究的主攻课题”之一。
集落形成法（HTCA）
四唑蓝比色法 (MTT)
细胞毒性差异染色法 (DiSC)
胸腺嘧啶核苷掺入法 (3HTdR)
原代瘤细胞培养药敏检测方法的几点提示

本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再作为独立的药敏检测方法。
20 0
ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0016
传统化疗(n = 17)
传统化疗(n = 17)
0 50 100 150 200 250
100
150
200
250
Weeks
Weeks
引自Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 1998, 9: 51-57

（二）原代瘤细胞培养

体外药敏预测一般采用短期原代培养。在无菌条件下，用机械法和／或酶消化法，将新鲜肿瘤标本分离为组织块、细胞团或分散的单个细胞（视瘤组织多寡及所用培养方法而定），与各种抗癌药分别作用一定时间后，与对照组比较，可计算用药组的瘤细胞杀伤比例，测出抗癌药物敏感度。
主要的原代瘤细胞培养药敏检测方法及其存在的问题

肿瘤体外药敏检测

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肿瘤体外药敏检测

ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术在治疗非小细胞肺癌胸水中的临床应用

肿瘤药敏检测技术

肿瘤体外药敏试验与临床实用研究进展

TCA技术原理

消化道肿瘤体外化疗药物敏感性与临床特征的相关性

肿瘤患者体外药敏试验的研究进展

浅谈肿瘤化疗药敏试验方法

肿瘤体外药敏检测

体外肿瘤药敏试验对原发性肝癌个体化化疗的应用价值分析

最新ATP-生物荧光体外抗肿瘤药敏检测技术主要临床研究文献

实体肿瘤体外药敏技术研究进展及其临床应用研究

非小细胞肺癌的体外药敏实验及其临床价值的开题报告

应用MTT法进行体外抗肿瘤药敏试验影响因素研究

ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测方法的应用探讨

肿瘤组织块体外药敏试验在肺癌化疗中的应用

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