金莲花抑菌抗病毒活性成分的初步研究

第31卷第4期2004年7月JournalofZhejiangUniversity(ScienceEdition)http:󰃗󰃗www.journals.zju.edu.cn󰃗sciVol.31No.4Jul.2004

收稿日期:2004201214.基金项目:广东省中医药管理局资助项目(100064)、国家自然科学基金资助项目(20172020)、省自然科学基金资助项目(粤科基(2001)10号-010401).作者简介:林秋凤(1979-),女,硕士研究生,主要从事天然产物研究.金莲花抑菌抗病毒活性成分的初步研究林秋凤,冯顺卿,李药兰,岑颖洲,杨宜婷,王凌云(暨南大学化学系,广东广州510632)摘　要:用柱层析等色谱分离手段从金莲花中得到3个纯化合物,通过UV、IR、1H2NMR等现代波谱技术分别鉴定为原金莲酸、牡荆甙和荭草甙Λ对上述化合物和所提取的总黄酮样品进行抑菌、抗病毒活性研究Λ结果表明,总黄酮、牡荆甙和荭草甙对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌有很好的抑制效果,并对副流感病毒有强的抑制作用Λ该项研究是由本实验室首次报道Λ关　键　词:金莲花;原金莲酸;牡荆甙;荭草甙;抑菌;抗病毒中图分类号:O629.5 文献标识码:A 文章编号:1008-9497(2004)04-412-04LINQiu2feng,FENGShun2qing,LIYao2lan,CENYing2zhou,YANGYi2ting,WANGLing2yun(DepartmentofChemistry,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)StudyontheantibacterialandantiviralactivitycompositionsofTrolliuschinensisBunge.JournalofZhejiangUniversity(ScienceEdition),2004,31(4):412～415Abstract:Proglobefloweryacid,orientin,vitexinwereisolatedfromthen2butanolextractofTrolliuschinensisBunge.Theantibacterialandantiviralactivitiesagainstsomebacteriaandviruswereinvestigated.Theresultsshowedthatthetotalflavones,orientin,vitexinexhibitedantibacterialactivitiesinvariousdegreesagainstthebac2teria;proglobefloweryacidexhibitedantivirusactivityagainstFluAvirus,orientinandvitexinshowedevidentan2tivirusactivitiesagainstpara3virus.Thisresearchwasfirstdonebyourlab.Keywords:TrolliuschinensisBunge;proglobefloweryacid;orientin;vitexin;antibacterial;antiviral 金莲花系毛莨科植物金莲花TrolliuschinensisBunge的干花,广泛分布于我国东北、华北和内蒙等地,药源丰富[1]Λ现代药理研究表明,金莲花水提液有明显的抑菌作用,抑菌谱广[2],在体外对某些呼吸道病毒也有一定的抑制作用[3]Λ临床观察表明金莲花水提液对急性阑尾炎、痢疾、上呼吸道感染及绿脓杆菌感染等有较好的疗效[4],其抑菌有效成分为黄酮类化合物[2,4]Λ但未见其单一化学成分的活性报道Λ作者从金莲花的正丁醇萃取物中分离出原金莲酸、牡荆甙和荭草甙,研究其抑菌及抗病毒活性,并测定了牡荆甙和荭草甙的质量分数Λ1　材料与仪器1.1　材　料金莲花,由广东省药材公司提供;聚酰胺薄膜,柱层析用聚酰胺粉,购自浙江省台州市路桥四青生化材料厂;菌种:枯草芽胞杆菌ATCC6633、表皮葡萄球菌ATCC12228、金黄色葡萄球菌ATCC6538P、藤黄微球菌ATCC9341由暨南大学医学院微生物与免疫教研室提供;病毒与细胞:呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感3型病毒(para3)、Hep22细胞(喉癌细胞)、病毒唑均由美国ATCC(美国典型微生物菌种保藏公司)提供;A型流感病毒(FluA)由广州中医药大学提供ΛDMEM培养基、PBS由美国Sigma公司提供;胰蛋白酶2EDTA(×10)、胰蛋白酶(1∶250),由美国Gibco公司提供;小牛血清(FBS)由美国Biofluids公司提供Λ1.2　仪　器UV2260紫外可见分光光度计(日本岛津);ZF2I型三用紫外分析仪(上海);INOVA500兆赫超导核磁共振仪(美国Varian公司);ZAB2HS双聚焦质谱仪(英国VG公司);EQUINOX55傅立叶变换红外光谱2红外显微镜联用仪(德国Bruke公司);Nicole25DXFouriertransfer红外仪(日本岛津);高效液相色谱仪(ShimadazuLC210A);CS29301型双波长飞点式薄层扫描仪(日本岛津)Λ2　实验方法2.1　提取和分离称取1kg干燥金莲花,用12倍60%乙醇回流提取3次,每次1.5h,过滤,合并提取液,减压浓缩,得乙醇粗提物342gΛ取乙醇粗提物300g,用正丁醇萃取,萃取液经减压浓缩后得深黄色粉末116gΛ该样品经聚酰胺柱层析,用乙醇2水梯度洗脱,将其中的10%乙醇洗脱液浓缩,再经聚酰胺柱乙醇2水梯度洗脱后得一白色固体,然后再用乙醇2水重结晶得白色针状晶体化合物I(95mg)Λ另外再将其中的20%乙醇洗脱液减压浓缩后经聚酰胺柱和硅胶柱层析得两黄色粉末化合物,经甲醇重结晶得黄色针状晶体化合物󰂫(15mg)和黄色晶体化合物󰂬(32mg)Λ取1g乙醇粗提物经聚酰胺柱层析,先用水,再用甲醇洗脱,在层析过程中,用聚酰胺薄膜定性跟踪,显色剂为1%三氯化铝乙醇溶液,在365nm紫外灯下观察薄层上斑点的荧光反应,并用盐酸2镁反应平行验证,将呈阳性反应的流份合并,减压浓缩至干得黄色粉末106.5mg,此黄色粉末即为总黄酮Λ2.2　总黄酮、牡荆甙和荭草甙的质量分数测定2.2.1　总黄酮质量分数的测定[5]乙醇粗提物经聚酰胺柱处理后,收集甲醇洗脱流份,用紫外分光光度法测定金莲花中总黄酮的质量分数Λ2.2.2　薄层扫描法测定牡荆甙、荭草甙质量分数[6] 以V(氯仿)∶V(丙酮)∶V(无水乙醇)∶V(水)=4∶2∶3.6∶0.4为展开剂,采用双波长薄层扫描仪测定了金莲花中牡荆甙的质量分数,同时利用牡荆甙的回归方程求算荭草甙的质量分数Λ2.2.3　HPLC法测定牡荆甙、荭草甙质量分数[7] 用HypersilBDSC8柱(10Λm),流动相为V(乙腈)∶V(0.8%醋酸水溶液)=95∶15,流速为1.1mL󰃗min,柱温40℃,在340nm下检测金莲花中牡荆甙的质量分数,同时利用牡荆甙的回归方程求算荭草甙的质量分数Λ2.3　体外抑菌活性实验采用微量稀释法[8]Λ在96孔微量板中依次加入用MH肉汤对倍稀释的供试液50ΛL以及各菌液(集落形成单位为1.5×106󰃗mL)50ΛL,于35℃培养20～22h,加入5%TTC5ΛL,继续培养1～3h,观察细菌的生长,孔显红色表明有细菌生长Λ结果判断以无可见细菌生长的最低药物浓度为药物对测试菌的最小抑制浓度(MIC)Λ2.4　体外抗病毒活性实验2.4.1　细胞毒性评价[9,10]在96孔板上进行,通过观察供试液对Hep22细胞的细胞病变情况(CPE)得到Λ2.4.2　抗病毒活性评价[9,10]在96孔板上进行,供试液以最大非细胞毒性浓度(MNCC)为初始浓度进行对半稀释,再加入病毒混悬液(100TCID50)Λ在CO2培养箱中37℃培养2～5d后,观察Hep22细胞病变(CEP)情况Λ阳性对照药为病毒唑利巴伟林Λ3　结果与讨论3.1　结构鉴定化合物I为白色针状晶体,熔点为141～142℃;化合物II和化合物III均为黄色晶体,熔点分别为239～240℃和255～256℃Λ对这3个晶体进行波谱分析,UV、IR、1H2NMR、MS与文献[11,12]报道基本一致,其理化性状和熔点也与文献[11,12]报道一致,综合理化性质和波谱数据可知化合物I为原金莲酸,化合物󰂫为牡荆甙,化合物󰂬为荭草甙Λ这3个化合物的结构式见图1Λ3.2　总黄酮、牡荆甙及荭草甙质量分数测定结果金莲花中总黄酮质量分数为4.612%Λ薄层扫描法测定金莲花中牡荆甙质量分数为0.442%,RSD=4.00%,荭草甙质量分数为01832%,RSD=2.94%,回收率为96.99%ΛHPLC法测定金莲花中牡荆甙质量分数为01457%,RSD=1.01%,荭草甙质量分数为1.03%,RSD=2.20%,回收率为99.32%Λ牡荆甙和荭草甙的质量分数经薄层扫描法和高效液相色谱法测定,结果基本一致Λ薄层扫描法用于天然药物的分析,方便快捷,一块板可以同时测定多个样品;而高效液相色谱法具有灵敏度高,样品用量少等特点,两者是互为补充的两种不同体系的色谱定量方法Λ314　第4期林秋凤,等:金莲花抑菌抗病毒活性成分的初步研究图1　原金莲酸、牡荆甙、荭草甙的结构式Fig.1　Chemicalstructuresofproglobefloweryacid,vitexinandorientin3.3　体外抑菌活性实验结果总黄酮、原金莲酸、牡荆甙和荭草甙对藤黄微球杆菌和枯草芽胞杆菌的MIC均大于200Λg󰃗mL;原金莲酸对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MIC均为200Λg󰃗mL;总黄酮对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MIC分别为50Λg󰃗mL和25Λg󰃗mL;牡荆甙对这两种菌的MIC分别为100Λg󰃗mL和25Λg󰃗mL;荭草甙对这两种菌的抑制效果最佳,其对这两种菌MIC均为25Λg󰃗mL.3.4　体外抗病毒活性实验结果样品的体外抗病毒活性实验结果见表1Λ表1　样品的抗病毒活性Table1　Antiviralactivitiesofthetestcompounds供试样呼吸道合胞病毒IC1)50TC2)50TI3)A型流感病毒IC50TC50TI副流感病毒IC50TC50TI原金莲酸184.2736.74.0184.2737.64.0184.2737.64.0牡荆甙——————20.8333.316.0荭草甙——————11.7375.032.1总黄酮7.074.612.7>100.0149.2<1.574.674.61.0病毒唑2.662.524.062.5>125>2.05.262.512.0　注　1)为对病毒的半抑制质量浓度,单位为Λg󰃗mL;2)为对细胞的半毒性质量浓度,单位为Λg󰃗mL;3)为治疗指数,TI=TC50󰃗IC50 由表1中数据可知,总黄酮对这3种病毒只有弱的抑制作用;原金莲酸对A型流感病毒有较强的抑制作用,其IC50为184.2Λg󰃗mL,TI为4.0Λg󰃗mL;荭草甙和牡荆甙对副流感病毒有强的抑制作用,其IC50分别为11.7和20.8Λg󰃗mL,治疗指数TI分别为32.1和16.0Λ4　结　论据报道,金莲花的水提物有一定的抑菌和抗ECOH病毒的活性[2,3],其抑菌活性成分主要为黄酮类物质[2]Λ但前人对金莲花抑菌和抗病毒的研究主要集中在其水浸提物上[2,3],未对金莲花中具体的化学成分进行活性研究Λ本课题组从金莲花中分离出原金莲酸、牡荆甙和荭草甙,并首次对这3个化合物及总黄酮进行了抑菌和抗病毒的研究Λ研究结果表明,金莲花中的抑菌活性成分除文献已报道的总黄酮外[2],非黄酮类物质原金莲酸也有较好的抑菌效果Λ荭草甙和牡荆甙对供试菌有较强的抑菌活性Λ其中荭草甙和牡荆甙对表皮葡萄球菌的抑制作用与总黄酮相当,其MIC均为

25Λg󰃗mL,而荭草甙对金黄色葡萄球菌的抑制作用优于总黄酮,其MIC比总黄酮低了25ΛgΛ抗病毒实验结果表明,总黄酮对呼吸道合胞病毒、A型流感病毒和副流感病毒均有一定的抑制作用,尤其是牡荆甙和荭草甙对副流感病毒有较强的抑制作用Λ另外,作者还测定了金莲花的抑菌、抗病毒活性成分总黄酮、牡荆甙和荭草甙的质量分数,为进一步开发利用金莲花提供了科学依据Λ参考文献(References):[1]　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1979.27:86.FloraReipublicaePopularisOinicaeAgendaeA2cademiaeSinicaeEdita.FloraReipublicaePopularisSinicae[M].Beijing:SciencePress,1979.27:86.[2]　苏连杰,刘丽娟,郭桂滨,等.长瓣金莲花不同药用部位的综合研究[J].中医药信息,1996,13(2):49-50.SULian2jie,LIULi2juan,GUOGui2bin,etal.Com2414浙江大学学报(理学版)第31卷