第十二章 生化实验技术

1.刻度吸量管：
• ⑴刻度吸量管的种类：
• ①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、 1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的 容积可达移取量的0.1-1%。通常将管身标明 的总容量分刻为100等分。因此，10ml的吸 量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表 0.01ml,其余类推。
禁止平放在实验台面上！ 洗涤（操作结束后）
㈡ 定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是 吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产 地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。
• 1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅 速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品 （只换吸嘴即可）。
• ⑵可调式：在一定容量范围内可根据需要进行 调节取加样量。例如规格为50～200μl的可调 式定量吸液器，可以在50到200μl的范围内根 据需要调节成设计容许的各种取加样容量 （60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等）。
• 4.新购置的玻璃仪器，应先置于1-2%稀盐酸 溶液中浸泡2-6小时，除去附着的游离碱，再 用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2-3次。
总的原则：凡用过的玻璃仪器，均应立即洗 涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗 涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后 按常规处理。
二. 吸量管的使用
吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用 来转移一定体积溶液的量器。 ㈠ 吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用 的是刻度吸量管。
• ⑸吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水 冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验 结束后集中仔细清洗。
三. 溶液的混匀
㈠混匀的目的： • ⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接
触，充分进行反应；

通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、 DNA制备的基本原理和操作，学习如何 进行实验设计，掌握实验过程中的关键 环节，对实验中出现的问题进行科学的 分析；在学习实验技术的同时，自觉培 养分析问题和解决问题能力。
思考题（课前设疑）
1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物 质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件 下容易变性？
原料选择和预处理
选什么样的原材料应视生产目的而定。 一般要注意以下几个方面:
1．要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行； 4．成本比较低； 5．经济效果要好。
如蛋白质原料的选择
蛋白质类生化产品的原料来源有动植 物组织和微生物等，原则是要选择富含所 需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提 取的无害生物材料。
实验实施要求：平时按各组计划时间分 别进行实验，组长有义务指导下组相关 实验内容，每次实验必须登记。
全班交流：实验结束安排课堂讨论交流， 每组准备一人汇报，一人记录；要求用 PPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难 点，其他组学生质疑，教师点评。
指导教师：汪财生、斯越秀
实验项目训练目标
12实验目标?掌握免疫球蛋白igg的原理和方法?掌握利用紫外法单向免疫扩散法等测定igg含量的方法?掌握sdspage电泳法鉴定蛋白质纯度及测定分子量方法?掌握层析透析膜分离电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作13实验要求掌握的技术柱层析分离技术sephadexg25分子筛层析deaecellulose离子交换层析蛋白质提取技术硫酸铵盐析透析膜分离技术等蛋白质含量测定消光系数法folin酚法测定igg蛋白质含量蛋白质分子量纯度活性测定sdspage电泳法检测单向免疫扩散法猪脾脏dna提取及含量鉴定实验二21内容提要为了研究dna分子在生命代谢中的作用常常需要从不同的生物材料中提取dna

《生化实验技术与应用》实验设计方案实验项目：水果基因组DNA 的提取与转基因成分分析 专业：生物技术 班级：101 日期：3月1日 一、实验目的：1、掌握提取植物组织基因组DNA 的基本方法。

2、掌握二苯胺法和紫外分光光度法测定DNA 含量的原理和方法。

3、学会转基因植物转基因成分的分析4、学习DNA 的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。

5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。

二、实验原理：核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。

核酸分为DNA 和RNA 两大类，前者主要存在于细胞核内，后者主要存在于细胞质及核仁里。

在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA 则溶于上层水相。

将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA 的少量溶解。

95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase 降解RNA ，可得较纯的DNA 。

DNA 含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm 有吸收峰，根据公式[DNA(μg /mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA 的浓度。

由于蛋白质在280nm 有吸收峰，可根据比值判断DNA 纯度：A260／A280＜1.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8＜A260／A280＜1.9时，表明样品较纯；A260／A280＞2.0时，表明RNA 或DNA 碎片较多。

二苯胺法定量测定DNA 的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA 中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。

其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。

DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA 含量成正比。

在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。

生化试验技术绪论1．生物体内某一组份，大致可分为五个基本阶段：(1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。

(2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。

(3)材料处理及抽提方法的选择。

(4)分离纯化方法的摸索。

(5)获得制备物以后，均一性的测定。

212(1)呈色法；(2)色谱法；(3)光谱法；(4)电泳法；(5)核磁共振波谱法。

(6)其他:如电子显微镜观察。

理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。

33．好的分析鉴定方法必须满足以下要求:1）特异性和专一性强；2）重现性好；3）准确度大；4）灵敏度高；5）手续简便。

4．制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。

5．材料的处理：1）选材：（1）工业生产：材料来源丰富、含量高、成本低；（2）未知物质：只要达到实验目的即可。

2）预处理：保证材料的纯净；3）组织破碎方法：（1）机械法：组织捣碎机，匀浆器，研钵和研磨、压榨机（2）物理法：(1)反复冻融法(2)急热骤冷法： (3)超声波处理（3）化学及生物化学法：(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6．使生物活性物质保持活性，主要措施常有如下几点：1）采用缓冲液。

2）加入保护剂。

3）抑制水解酶的破坏4）一些特殊的措施：引起生物大分子变性的因素，如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免，有的还要求提取时无氧等。

第一章1．蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？1）溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法； 2）分配系数不同：如分配层析法3）吸附性不同：如吸附层析法； 4）在电场中运动速度不同：如电泳法5）沉降系数或密度不同：如离心法；6）分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法；7）生物学特性不同：如亲和层析法；2．蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项？蛋白质的分离提取的一般步骤为：一般来说，蛋白质的制备包括以下过程：(1)材料的选择和预处理；(2)破碎生物组织(原料是细胞外分泌物时无需此步)，并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来；⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒如核．线粒体．微粒体或核糖体及细胞碎片与溶液分开；(4)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(5)进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开；(6)根据具体产品要求，在适当条件下将蛋白质形成结晶或制成冻干粉。