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生物化学实验技术PowerPointPresenta.pptx

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生物化学检验常用技术(共66张PPT)

生物化学检验常用技术(共66张PPT)
4、Lambert-Beer定律的偏离现象
单色光 均匀介质 吸收物质无相 互作用
5、空白溶液的选择
在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的干扰、抵消比色皿和 试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100%的溶液。
不
蒸 馏 水
试
样
含 待
剂
品
测
元
不
显 色
素
1、溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。
常用的固定化技术有：吸附、试剂交联、共价键合、
包埋法(酶与载体聚丙酰胺混合后直接包在电极 敏感部分形成酶凝胶层)。
几种酶电极的品种与性能
测定物质
酶
检测物 测定范围(mol/L)
葡萄糖 葡萄糖氧化酶
尿素(脲)
脲酶
胆固醇 胆固醇氧化酶
L－谷氨酸 谷氨酸脱氢酶 L－赖氨酸 赖氨酸脱羧酶
O2 NH3 H2O2 NH4+ CO2
单色器
滤光片
棱镜
光栅
吸收池
检测器
玻璃比色皿
石英比色皿
显示器
4
(一)、分光光度技术的基本原理
1、吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光 被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透 光度，即：
入射光 I0
透射光 I
T = I/I0
10-4～2*10-2 10-5～10-2 10-5～10-2 10-4～10-1 10-4～10-1
离子选择性电极的分析方法

《生物化学实验》PPT课件

《生物化学实验》PPT课件
掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术， 尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加 科研工作打下坚实的基础。
编辑ppt
24
3 实验记录与实验报告
3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上
设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量 的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽 可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差 很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试 剂的浓度等。
编辑ppt
25
3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告
实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的；
⑵ 实验原理；
⑶ 仪器、材料和试剂；
⑷ 实验步骤；
⑸ 结果讨论（含数理据处）；
⑹ 注意事项;
(7) 思考题
注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
编辑ppt
35
（2）离子交换层析
原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固 定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。
常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交 联剂：二乙烯苯）
阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+
编辑ppt
21
7、实验六 酵母RNA的提取和鉴定 (4学时) 8、实验七 血糖含量的测定 （4学时） 9、实验八 脂肪酸的β-氧化 （5学时） 10、实验报告讲解及考核 （2学时）编辑ppt22绪论1 实验目的

《生物化学实验》PPT课件

《生物化学实验》PPT课件

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24
四.几种常见电泳的比较
类型
优点
缺点
纸电泳
设备操作简单
分辨率差，电渗现 象
醋酸纤维薄膜电 设备操作简单，样品
泳
用量少
分辨率差
琼脂糖凝胶电泳 快速，分辨率高
电渗现象严重
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
可调节凝胶孔径，样 品用量少分辨率高，
无电渗现象
高浓度凝胶难剥离
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25
五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理
A.凝胶层的不连续性
浓缩胶T=2.8％ C=20%；分离胶T=7％ C=2.5%
B.缓冲液成分的不连续性：
凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly
－
C.pH的不连续性：
浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3
D.电位梯度的不连续性
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30
五. 盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 （2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应
样品的浓缩效应
电荷效应
分子筛效应
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31
A. 样品的浓缩效应
缓冲液成分及pH的不连续性 浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly
解离度 ：Cl> 蛋> Gly mcl cl>m蛋 蛋>m Gly Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，
蛋白质从“－”极向“＋”极移 动，从浓缩胶进入分离胶，速 度变慢，堆积浓缩。
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缓冲 液
浓缩胶 分离胶
40
B.电荷效应
蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增 大，不存在快、慢离子之分， 蛋白质样品在均一电场强度和 pH条件下泳动。

生物化学实验技术-PowerPointPresenta

生物化学实验技术-PowerPointPresenta

样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
【方法步骤】
• 1．取干净试管8支，按下表正确操作：
试剂 1
2345678
0.02M 基质液
0.1
蒸馏水 1.3
碳酸盐
缓冲液 1.5
0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.2 1.1 1.0 0.8 0.6 1.4 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 混匀置37℃水浴保温5分钟
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
钼蓝 通过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！
【实验操作】
1．动物准备 取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重
（一般为2～3kg）。 2．取血
以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳， 使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺 破静脉放血，将血液收入抗凝管中（按10：1 的比例将防凝剂放入试管，边收集（量约3ml） 边摇匀，以防凝固。 用干棉球压迫血管止血。
【实验原理 】
1.体内血糖水平主要依靠激素的调节

生物化学检验ppt课件

生物化学检验ppt课件
酶类CK-MB,α-AMY等。
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、

生物化学实验技术PPT课件

生物化学实验技术PPT课件

特定DNA片段
农业生物学实验教学中心
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。
PCR反应循环
Taq
P2
Mg2+
2021/3/12
P1
dATP dCTP
dTTP
dGTP
农业生物学实验教学中心
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA
结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
5’ 3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
SG
农业生物学实验教学中心
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
2021/3/12
农业生物学实验教学中心
一、实验目的
PCR示例
学习PCR分析的原理与技术。
2021/3/12
农业生物学实验教学中心
二、实验材料、仪器和试剂
1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体
基因组DNA结构功能的研究
农业生物学实验教学中心
低浓度引物
高浓度引物
2)反向PCR (reverse PCR)
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段， 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
未知序列
已知序列

生物化学实验课件ppt课件

生物化学实验课件ppt课件
（8）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、 窗是否关闭，以保证实验室安全。
（9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊 慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。
实验一 糖类的性质实验
ppt课件
9
糖类的重要鉴别方法是 Ｍｏｌｉｓｈ反应和Ｓｅｌｉ ｗａｎｏｆｆ反应。糖类、苷类及其他含糖物质与α 萘酚和 浓硫酸呈紫红色的环的反应称为 Ｍｏｌｉｓｈ反应，该反应 可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和６ｍ ｏｌ／Ｌ盐酸能产生红色的反应称为Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ 反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯 二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖 的反应速度要慢得多。
ppt课件
17
四、实验步骤
1、α-萘酚反应
1%葡萄溶液
观
1%果糖溶液 各加1ml
★各加2滴
★各加1ml
察
5
记
1%蔗糖溶液
支
莫氏试剂 混
浓硫酸
录
试
各
1%淀粉溶液
管
匀
管
0.1%糠醛溶液
颜 色
ppt课件
18
Molisch反应（-萘酚反应）
界面：显色------鉴定：所有的糖类均可显色
浓H2SO4
糖 α -萘酚+酒精
ppt课件
11
一、实验目的：
1、了解糖类某些颜色反应的原理； 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法； 3、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及
其原理。
ppt课件
12
二、实验原理
(一)颜色反应
1. α-萘酚反应
糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）作用下，脱水生

生物化学实验设计PPT课件(初中科学)

生物化学实验设计PPT课件(初中科学)

。
实战演练：
（09杭州）某同学将生长状况类似的A、B二盆蚕豆幼苗分别置于
两个暗箱中，在B盆蚕豆幼苗的暗箱右侧开一小窗口，并在窗口外
侧装一个固定光源，保持其它环境条件适宜并相同。一星期后，
A,B两盆蚕豆幼苗的生长状况如图所示。请回答下列问题：
(1)该同学设计这一实验的目的是为了探究
单侧光对蚕豆幼苗生长的影响
（3）每组为什么要选用较多数量的胚 减少由于种子死亡 ？
或遗传差异带来的误差
实战演练：
(4）小芳同学认为叶绿素的合成除了需要镁等矿物质 元素外，还需要其他的一些环境条件。她设计了如下 表的方案。
分析小芳同学的实验设计，你认为她要研究的问题
是 叶绿素的合成是否需要光
。
根据实验设计方案提出研究问题的技能是:
。
化学实验设计和评价
❖ 化学实验设计题和实验评价题是对学生进行实验综合能力考 查的题型之一，是当前课程改革和中考所关注的热点。其命 题方式通常有：①设计反应原理 ②设计实验装置 ③设计操 作程序 ④侧重于某一要求的综合设计并含定量设计要求⑥以 批评的思想方法对所提供的实验方案进行评价。
❖ 解答实验设计题时，必须遵循“四性”：科学性、可行性、 规律性、创新性。即原理正确、操作简便、现象明显、药品 经济、结论可信、有创新意识。解答实验评价题时，要环绕 题目提供的多种方案，从原理是否科学合理、操作是否简单 可行、所用试剂是否经济、实验现象是否明显、是否体现 “绿色化学”等方面进行评价。
不同浓度的重金属污染液中的种子萌发率都比
蒸馏水中的低，幼苗根长也较短。随着重金属浓度 的升高，种子萌发率降低，幼苗根长也缩短。
活动二：
设计一份实验记录单
培养皿
污染液 浓度 萌发率

《生物化学实验教案》课件

《生物化学实验教案》课件

《生物化学实验教案》PPT课件第一章：生物化学实验基本原理与技能1.1 生物化学实验的目的与意义解释生物化学实验在生物学和医学研究中的重要性强调实验对于理论知识的巩固和应用的作用1.2 生物化学实验的基本原则介绍实验设计的科学性和合理性强调实验操作的准确性和可重复性1.3 生物化学实验的基本技能介绍实验室安全操作规程演示实验室常用仪器的使用方法第二章：生物化学实验数据处理与分析2.1 实验数据的记录与处理讲解实验数据的记录方法和注意事项介绍数据处理的基本原则和方法2.2 实验数据的分析与解读讲解实验结果的统计分析方法强调数据分析在实验结果解释中的重要性第三章：生物化学实验操作技巧与实例3.1 生物化学实验操作技巧讲解实验操作中的注意事项和技巧强调实验操作的精确性和规范性3.2 生物化学实验实例解析介绍经典生物化学实验案例分析实验操作步骤和结果的关联性第四章：生物化学实验常用仪器与设备4.1 生物化学实验常用仪器介绍实验室常用仪器的作用和操作方法强调仪器使用中的注意事项和维护保养4.2 生物化学实验常用设备讲解实验室常用设备的结构与功能强调设备操作的安全性和正确性第五章：生物化学实验安全与环保5.1 生物化学实验安全知识讲解实验室安全的基本原则和措施强调实验操作中的安全意识和风险控制5.2 生物化学实验环保知识介绍实验室废物的分类和处理方法强调实验室环保的重要性和责任意识第六章：蛋白质实验6.1 蛋白质的提取与分离介绍蛋白质提取和分离的基本原理演示蛋白质提取和分离的实验步骤6.2 蛋白质的纯化与鉴定讲解蛋白质纯化方法和技术介绍蛋白质鉴定的方法和原理第七章：酶实验7.1 酶的提取与纯化讲解酶提取和纯化的方法和原理强调酶活性检测的重要性7.2 酶活性的测定与分析介绍酶活性测定的方法和原理讲解酶活性数据分析的方法和技巧第八章：碳水化合物实验8.1 碳水化合物的提取与分析介绍碳水化合物提取和分析的方法强调碳水化合物在生物体中的重要性8.2 碳水化合物的代谢实验讲解碳水化合物代谢的实验方法和原理介绍碳水化合物代谢产物的检测方法第九章：脂质实验9.1 脂质的提取与分析讲解脂质提取和分析的方法强调脂质在生物体中的功能和作用9.2 脂质代谢实验介绍脂质代谢的实验方法和原理讲解脂质代谢产物的检测方法第十章：核酸实验10.1 核酸的提取与纯化介绍核酸提取和纯化的方法和原理强调核酸在生物体中的重要性10.2 核酸的检测与分析讲解核酸检测和分析的方法和原理介绍核酸序列测定和分析的方法重点和难点解析1. 生物化学实验基本原理与技能：理解实验设计的原则和实验操作的准确性是进行生物化学实验的基础。

《生物化学技术实验》PPT课件

《生物化学技术实验》PPT课件

完整版课件ppt
33
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34
■ 亲和层析作用机理：
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
配体
X
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(3)
Elution
A
B
35
亲和吸附剂的制备
• 分离纯化一定数量的游离配体 • 载体活化 • 配体与载体偶联
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36
完整版课件ppt
37
■ 亲和层析图谱：
酯键＞酰胺键＞肽键
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49
胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶) 和弹性蛋白酶三种酶在理化性质和结构 上均十分接近，利用一般常用的提取分 离方法，很难将它们之间彼此彻底分开 。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采 用亲和层折技术进一步纯化后，可达到 十分满意的效果。
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50
胰蛋白酶的天然抑制剂 -------鸡卵类粘蛋白(CHOM)
生物化学技术实验部分
(2010版)
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1
生物化学研究的核心任务： 阐明生命现象的分子机理。
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2
生物大分子物质制备的基本过程：
• 确定测定方法 • 材料的选择与处理 • 抽提 • 浓缩 • 纯化 • 有效成分纯度和性质的分析
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3
蛋白质的制备：
前处理
浓缩、粗分离
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59
胰蛋白酶的BAEE单位定义为： 在下列实验条件下，引起每分钟光吸收值 A253nm增加0.001的酶量。 • 底物（BAEE）浓度为1mmol/L • 反应液为0.05mol/L Tris-HCl,pH7.6 • 光程1cm • 反应温度25℃ • 波长253nm • OD值递增0.001/min

生物化学-PowerPointPresentation

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二、酶原及酶原激活
无活性的酶的前体称作酶原(zymogen)。无活 性的酶原转化为有活性的酶的过程称为酶原的激活。
酶以酶原的形式合成或初分泌具有重要的生物 学意义。第一，酶原可以保护组织细胞不受酶的作 用而被破坏。此外，酶原还可以视为酶的储存形式。 如凝血酶类和纤维蛋白溶解酶类以酶原的形式在血 液循环中运行，一旦需要便转化为有活性的酶，发 挥其对机体的保护作用。
•
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20.10.1920.10.19Monday, October 19, 2020
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人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。20:58:3120:58:3120:5810/19/2020 8:58:31 PM
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安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20.10.1920:58:3120:58Oc t-2019- Oct-20
从底物移去一个基团而形成双键或逆反应
AB
A+ B
例1：
例2：
5．异构酶类（isomerase）
催化异构化反应
例：
A B
6．连接酶类（ligases, 也称synthetases合成酶类）
将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。
例：
+ o + T o + + i
第二节 酶的分子组成
一、单纯酶 单纯酶是仅由氨基酸残基构成的酶，其催化活
（三）六大类酶催化反应的性质
1．氧化还原酶类（oxido-reductases）
催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、 脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。
（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2 。
2A·2H+O2

生物化学PPT课件

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生物化学的应用领域
01
02
03
04
医学研究
生物化学在医学领域中发挥着 重要作用，如疾病诊断、药物
研发和生理机制研究等。
农业生产
通过生物化学手段改良作物品 质、提高产量，以及研发新型
肥料和农药。
环境保护
利用生物化学方法处理环境污 染问题，如水体净化、土壤修
复等。
生物技术产业
生物化学在生物技术产业中具 有广泛应用，如基因工程、蛋
合成生物学
合成生物学是新兴的交叉学科，旨在设计和构建人工生物系统，实现新功能或 优化现有功能。通过合成生物学，科学家可以创建定制化的微生物，用于生产 燃料、药物和其他有用物质。
纳米技术与生物医学应用
纳米药物
纳米药物利用纳米技术将药物包裹在 纳米载体中，以提高药物的靶向性、 稳定性和生物利用度，降低副作用。 纳米药物在癌症治疗、疫苗开发等领 域具有广泛应用前景。
生物合成与分解代谢
生物合成
生物合成是指生物体利用简单无机物和单糖等合成复杂有机 物的过程。生物合成包括脂肪酸、蛋白质、核酸等物质的合 成。这些合成过程需要经过一系列酶促反应的完成。
分解代谢
分解代谢是指生物体将大分子有机物分解成小分子有机物和 无机物的过程。这些分解过程包括糖酵解、柠檬酸循环和氧 化磷酸化等。分解代谢是生物体获取能量和合成物质的重要 途径。
结论总结
根据实验结果和讨论，总结实验的结论，指 出研究的局限性和未来研究方向。
结果讨论
对实验结果进行深入分析和讨论，探讨结果 的合理性和科学性。
结论应用
探讨实验结论在实际生产和科研中的应用价 值和意义。
05
生物化学前沿研究
基因编辑与合成生物学
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实 验二
紫外分光光度法测定蛋白质含量
【目的要求】 • ①了解分光光度法的基本原理； • ②能较熟练使用紫外分光光度计。
• 【实验器材】 • 1．紫外分光光度计。 • 2．微量加样器。 • 3．蛋白标准液（1mg/ml）。
【方法步骤】
• 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏 定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓 度为1mg/ml的蛋白质溶液。
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
（2）盐析的影响因素
蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH 值、温度等。
本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液 中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在 33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。
2.层析：
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相） 时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及 亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
（3）收集：
加样同时可进行收集，每管收集1ml。 收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶 和尼龙布等。
⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液 各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一 块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无 呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内 加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。
⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再 逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。 静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖 子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球 蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。
2.脱盐：
⑴ 装柱：将制好的葡
（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素
①电荷(同种电荷相斥）
++
②水化膜（隔离） + Pr +
++
中性盐破坏了这两个稳定#43; Pr +
++
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的 水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入 蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋 白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
• 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 • 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 • 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 • 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 • 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 • 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 • 实 验七、 SGPT活性测定 • 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 • 实 验九 、RNA的分离与鉴定 • 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 • 实 验十一、 质粒的提取与鉴定
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法 和原理；
2．熟悉盐析和层析的基本操作； 3． 掌握离心机的正确使用方法。
【仪器试剂】
试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、 层析柱、反应板；血清、PBS液、葡 聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸 铵溶液。
【实验原理 】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。
实验一
双缩脲法测定蛋白质含量
【目的要求】 • 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。
• 【实验器材】
• 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻 度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计
【方法步骤】
• 取中试管3支，按下表操作。
试剂（ml） 标准管
蛋白质标准 待测液 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 —— —— 5.0
样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
• 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度 （mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。
【注意事项】
• 1．加量要准确。 • 2．比色皿的正确应用。 • 3．结果重复3次，取平均值。
【思考题】
• 1．为何要同时测定蛋白280nm和 260nm处的光吸收值？
实验三
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
• 2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作
管号 1
2
3
4
5
6
蛋白标准 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
液（ml）
生理盐水
（ml） 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
• 混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光 径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光 度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白 质的浓度为横坐标绘制标准曲线。
3.检测分离效果
（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。
（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与 其呈现红色或紫红色。
【实验操作】
1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混 匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边 摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10 分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋 白）。
聚糖凝胶混匀，倾入层 析柱内，静止后分层， 凝胶高度要在柱高的 1/3~3/4之间。当液面接 近凝胶上表面时将出口 胶管夹紧待用。
注意：装柱要均匀，不要有气 泡和分层，凝胶面要平整
（2）加样：
向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴， 用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸 出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。 待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用 乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部 分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至 洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表 面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至 凝胶面以下。