生化实验技术与方法

实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。

因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。

常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。

通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。

二、复性。

降低温度使DNA单链分子同引物结合。

温度为55℃，时间1min。

三、延深。

升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。

同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。

经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。

PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。

3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。

每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。

4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。

Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。

5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。

在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。

实验一基本技术操作及吸光光度法*********************************************实验须知一、实验目的1、通过实验验证生化的基本理论，巩固所学知识。

2、掌握生物化学及分子生物学基本实验方法。

3、培养严谨、认真、实事求是的态度和正确的思维方法。

二、实验要求1、课前预习，课中认真做笔记。

2、按照实验室要求规范操作，如实记录实验结果。

3、认真，按时（当堂）完成实验报告。

三、试剂使用1、核对标签，切勿拿错试剂。

2、刻度吸管或移液器头（Tip头）与试剂必需一一对应，以免引起试剂的交叉污染。

3、用后盖好瓶盖，归还原处。

切勿张冠李戴。

四、仪器使用1、爱护仪器设备，严格遵守操作规则，注意安全。

2、精密仪器，未经允许，不得动用。

3、仪器出现故障，应立即关闭电源，报告老师。

五、实验室规则1、穿工作服进入实验室，遵守课堂纪律。

2、节约水、电、试剂，实验完毕后，清洗所用器材。

3、注意安全，若发生酸碱灼伤，应立即用大量清水冲洗。

4、值日生负责实验室卫生，倒尽垃圾，关好水电、门窗，收齐实验报告。

基本技术操作一：玻璃仪器的洗涤及干燥：（一）意义：去除干扰物，提高实验结果的准确性。

（二）常用洗涤剂：1．洗衣粉，肥皂，洗洁精，去污粉----用于一般去污。

2．强酸，强碱，尿素------去除蛋白质，核酸。

3．铬酸洗液------见附2。

4．水（自来水，蒸馏水）------用来冲洗容器。

（三）洗涤方法：* 洗涤程序：泡→洗（→泡）→冲→漱1．新仪器的洗涤：2%的盐酸浸泡数小时→自来水冲净→洗涤剂溶液中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。

2．非定量敞口仪器的洗涤（试管、烧杯等）用后立即放入洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→检查是否洗净→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。

实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性---即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。

分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。

特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快，2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高5，用途广泛。

二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。

溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。

能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。

3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外--可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。

透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。

吸光度A:透光率的负对数。

A愈大，溶液对光的吸收愈多。

5、Lambert-Beer定律Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。

式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。

三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。

可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。

生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。

而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。

2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/ I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm 的吸光度。

c=A/ε3. 定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2) 对比法元-KCLCxS SX X S X S X S X C A A C C C L KC L KC A A *,===即(3)计算法: e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5) 多组分湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。

使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。

2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。

v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达 0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。

生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。

而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。

2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/ I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm 的吸光度。

c=A/ε3. 定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2) 对比法元-KCLCxS SX X S X S X S X C A A C C C L KC L KC A A *,===即(3)计算法: e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5)多组分湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。

使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。

2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。

v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。

实验一 分光光度计线性分辨范围测定一. 目的1.学习分光光度计的工作原理，掌握比色测定的基本操作方法。

2.掌握标准曲线的制作及分光光度计最佳测试浓度范围的确定。

二. 原理比色法是常用的生化分析方法。

利用分光光度计可以很方便地完成多种生物物质的定量分析。

比色法的理论基础是朗伯-比尔定律，其测定浓度范围要求在分光光度计线性分辨范围内。

光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。

肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm ；小于400nm 的光线称为紫外光；大于750nm 的光线称为红外光。

当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。

图1 Lambert-Beer 定律示意图分光光度法依据Lambert-Beer 定律：II 0lg = KCL令A = II 0lg，T =0I I，则A = KCL ，A = -lgT其中：T ：透光率A ：吸光度（有时用光密度OD 表示）I ： 透射光强度 I 0：入射光强度 K ：吸收系数 L ：溶液的光径长度 C ：溶液的浓度从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K 和溶液的光径长度L 不变时，吸光度A 与溶液的浓度C 成正比。

用标准曲线法，即可对未知样品做定量分析。

三. 实验材料及设备1. 仪器UV5200型分光光度计。

2．器材I 0IC L刻度试管：25mL×21；移液器：1mL×1；吸头几支；烧杯：250mL×2，50mL×1；洗耳球：2；滴管：2；移液管（白线）：1 mL×1，2 mL×1，5 mL×1；洗瓶、试管架、移液管架：各1。

四. 试剂的配制0.01mol/L硫氰化铁（Fe (SCN)3）溶液：称取30.000g （过量）KSCN和27.05g FeCl3·6H2O，加入2.5mol/L HCl 100mL,用蒸馏水溶解后定容至10000mL（经验提示：保质期1星期）。

2021-02-10—2021-02-12学习总结：一、经常使用的生化检测方式1.终点法通过检测终点吸光度转变的大小来求出被测物的含量。

选择终点法的重要因素，终点时刻的确信a)依照时刻—吸光度曲线来确信：选取吸光度趋于稳固后的时刻b)依照被测物反映终点，结合干扰物的反映情形来确信如:溴甲酚绿法测血清白蛋白溴甲酚绿（BCG）是一种pH指示剂，变色域（黄色）（蓝绿色）溴甲酚绿不但与清蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成份呈色，其中以a1-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反映速度较清蛋白稍慢。

由于在30s内呈色对清蛋白特异，因此溴甲酚绿与血清混合后，在30s内读数可明显减少非特异性呈色反映。

1.1一点终点法反映达到终点，即在时刻—吸光度曲线上，当吸光度再也不改变时，选择一个终点吸光度值。

待测物浓度=（待测吸光度AU-空白AB）*K(校准系数)1.2两点终点法在被测物反映尚未开始时，选择第一个吸光度，在反映达到终点或平稳时，选择第二个吸光度，用两次吸光度之差计算结果。

优势：有效地排除溶血、黄疸和脂浊本身光吸收造成的干扰，适应于反映初期吸光度无明显转变的被测物。

1.3固按时刻法在时刻—吸光度曲线上选择两个测光点，既非反映物初始也非终点，差值用于计算结果例：苦味酸法测定肌酐，反映初30s,血清中快反映干扰物（微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）与碱性苦味酸反映；第二个30s要紧与肌酐反映，而且吸光度线性良好；80-120s以后，苦味酸能够与蛋白质和其他慢反映干扰物反映。

因此用第二个30s为测按时刻，有利于提高实验特异性和准确性。

1.4持续监测法也称速度法，测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，持续选择时刻—吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度转变值△A/min计算结果二、了解免疫学查验经常使用的技术1.免疫比浊技术原理：免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生必然大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。

⽣化与分⼦⽣物学实验指导⽣化与分⼦⽣物学实验指导-（)————————————————————————————————作者:————————————————————————————————⽇期:实验⼀氨基酸纸层析法⼀、实验⽬的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作⽅法。

⼆、实验原理纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是⽣物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常⽤技术,可⽤于蛋⽩质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。

纸层析法⼜称纸⾊谱法,是⽤滤纸为⽀持物,所⽤展层溶剂⼤多由⽔和有机溶剂组成,滤纸纤维与⽔的亲和⼒强,与有机溶剂的亲和⼒弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的⽔分是固定相,有机溶剂是流动相。

溶剂由下向上移动的,称上⾏法；由上向下移动的,称下⾏法。

将样品点在滤纸上(此点称为原点),进⾏展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进⾏分配。

由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率⽤Rf 值表⽰：在⼀定条件下某种物质的Ｒf 值是常数。

Ｒf 值的⼤⼩与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。

只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。

样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只⽤⼀种溶剂展层,就不能将它们分开。

为此，当⽤⼀种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再⽤另⼀溶剂展层,从⽽达到分离⽬的,这种⽅法称为双向纸层析法。

氨基酸⽆⾊,可利⽤茚三酮显⾊反应,将氨基酸层析点显⾊作定性、定量⽤。

所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产⽣蓝紫⾊物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产⽣(亮)黄⾊物质。

三、药品器材1器材层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪⼑、层析缸、⽑细管、电吹风、刻度尺、铅笔。

R ｆ=原点到层析斑点中⼼的距离原点到溶剂前沿的距离2试剂(1)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液(各组分浓度0．5％)。

常见的生物化学实验方法生物化学实验是研究生物分子结构、功能和相互作用的重要手段，广泛应用于生物医学研究、药物开发和环境保护等领域。

本文将介绍一些常见的生物化学实验方法。

一、色谱技术色谱技术是一种分离和分析物质的方法，根据分子的化学性质和大小差异，将混合物分离成各个组分。

常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC）等。

在生物化学实验中，色谱技术常用于对生物样品中的分子进行纯化和分析。

例如，气相色谱可用于分析氨基酸和脂肪酸等小分子化合物，液相色谱则可以用于分离蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。

二、电泳技术电泳技术是利用电场作用下物质的电荷和大小差异，将混合物分离成各个组分的方法。

常见的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和凝胶过滤电泳等。

在生物化学实验中，电泳技术常用于分离和检测蛋白质和核酸等生物大分子。

例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和测定蛋白质分子量，SDS-PAGE则可以用于检测蛋白质的纯度。

三、质谱技术质谱技术是利用质量分析仪器对物质的质量和结构进行分析的方法。

常见的质谱技术包括质谱仪、飞行时间质谱（TOF-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）等。

在生物化学实验中，质谱技术常用于鉴定和定量生物分子。

例如，利用质谱仪可以对蛋白质进行鉴定，通过测定样品中蛋白质的质量和碎片离子的质量谱图，确定蛋白质的氨基酸序列。

四、核酸杂交技术核酸杂交技术是利用互补的DNA或RNA序列进行结合，从而检测目标序列的方法。

常见的核酸杂交技术包括Southern blot、Northernblot和in situ hybridization等。

在生物化学实验中，核酸杂交技术常用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在。

例如，Southern blot可用于检测DNA片段在基因组中的分布和拷贝数，Northern blot则可用于检测特定mRNA的表达水平。