广西巴马小型猪内源性反转录B亚型病毒5′非编码区的序列扩增及分析

（ ５ Ｒ１和 Ｐ ＵＴＲ ） 另 外 合 成 反 转 录 引 物 Ｔ１ Ｐ ＵＴ ５ ２， ７ 和 Ｓ ＭＡＲＴ Ａ、 合引物 Ｌ ｎ — 混 ｏ ｇ和 Ｓ ｏ ｔ ｈ ｒ 以及套 式 引
物 ＮＵＰ（ １ 。 表 ）
表 ｌ ５ＲＡＣＥ引 物
Ｔａ ｌ ５ ＲＡＣＥ ｒｍ ｅ ｓ ｂｅ１ ｒ ｐ ｉ ｒ
名 称
Ｎａ ｍｅ Ｔ１ （ ） ７ ２５
序 列
Ｓｅ ｕ ｎ ｅ ５ 一 ３ ｑ ｅ ｃ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
赛生 物公 司测 序 ， 并将 序 列登 陆 Ｇｅ Ｂ ｎ 。 ｎ ａ ｋ
１ ２ ７ 生 物 信 息 学 分 析 用 Ｇｅ ｅｏ ｓ和 ｃｕ ｔｌ ．． ｎ ｉｕ ｌｓａ
关键词 ： 内源性反 转录病 毒 ； 西 巴马小型猪 ； ＡＣ ５ＵＴＲ 猪 广 Ｒ Ｅ；
中 图 分类 号 ： ８ ５ ３ ￥ ５． 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ７ ５ ３ （ ０ １ ０ — ０ ４０ １ ０ —０ ８ ２ １ ） １０ ２ — ５
猪 内源性反 转 录病 毒 （ ｏ ｃ ｅｅ ｄ ｇ ｎ ｕ ｅ— Ｐ ｒｉ ｎ ｏ ｅ ｏ ｓｒｔ ｎ
析 ， 增序 列 为 Ｂ亚 型 Ｐ ＲＶ ５ＵＴＲ。 一 级 结 构 分 析 表 明 ， 序 列 由 Ｕ３ Ｒ、 、 Ｂ 扩 Ｅ 一 该 、 Ｕ５ Ｐ Ｓ和 Ｌ ＡＤ Ｒ ５个 区域 Ｅ Ｅ
构 成 ， Ｇｅ Ｂａ ｋ 已发 表 的 其 他 序 列 相 比缺 少 ３ ４ｂ 。 通 过 ｐａ ｔ 与 ｎ ｎ ４ ｐ ｌｎ ＣＡＲＥ 数 据 库 鉴 定 ， ＧＵ３ ０ ３ ９ ２ ｌ序 列得 到
Ｌｇ． ｏｃ ｎｏ
Ｓｈ ｒ （ ） ｏ ｔ ２
ＮＵＰ（ ０ ２ ）
ｃＡ 雯 ＴＴ Ａ
￡
； Ａ Ａ ＧＧ ｃ
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＣ
Ａ ＡＧ Ｃ ＡＧ Ｔ ＧＧ Ｔ Ａ Ｔ ＣＡ Ａ ＣＧ ＣＡ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ
元 件 的定位 分 析借 助 ｐａ ｔ ＡＲ ｌｎＣ Ｅ数 据库 ， 串联 重 复
１ １ １ 抗 凝 血采 集 ．．
采 自广西 大 学 巴马小 型 猪 猪
场封 闭群 的血 液 ， Ｄ Ｅ ＴＡ 抗 凝 剂 、 １Ｐ Ｓ均 按 ＮＨ Ｃ 、 Ｂ
照文献 ［ ］ ７ 的方法 配制 。
１ １ ２ 主 要 试 剂 Ｔ Ｉｏ 购 自 Ｉ ｖｔｏ ｅ ． ． Ｒ ｚｌ ｎ ｉ ｇ ｎ公 司 ； ｒ 反
个循 环下 降 ０ ５℃ ， ２ ℃ ３ｍｉ ， ０个 循 环 ； ４℃ ． ７ ｎ１ ９
３ ， ０ 。 ４ ， ２ ℃ ３ ｍｉ ２ 个 循 环 ； 后 再 ０ｓ ５ Ｃ ５ｓ ７ ｎ， ０ 最
１ ２ １ 引 物 设 计 根 据 Ｇｅ Ｂ ｎ ．． ｎ ａ ｋ已 发 表 的 各 种 不 同 亚 型 的 Ｐ Ｒ 核 苷 酸 序 列 ， 照 Ｓ ＡＲ ＡＣ Ｅ Ｖ 参 Ｍ ＴＲ Ｅ 试 剂 盒 说 明 书 ， 用 生 物 信 息 学 软 件 ｃｕ ｔｌｘ ． ３ 利 ｌｓａ １ ８ 寻 找 Ｐ Ｒ ５端 保 守 区 ， 用 Ｏｌ ｏ ６结 合 Ｐ ｉ ｒ Ｅ Ｖ 再 ｉ ｇ ｒ ｍｅ ｐ ｅ ｅ ．０ 软 件 ， 计 两 条 基 因 特 异 性 引 物 ｒｍｉｒ５ 设
端重 复 序 列 （ ， 独 特 区 （ ） 引 物 结 合 区 Ｒ） ５ 端 Ｕ５ ，
等 发现 在 Ｐ ＲＶ ５ ＵＴ 的 Ｕ３区存 在 病毒 转 录 Ｅ 一 Ｒ 起 始点 （ａ ） ＴＡＴ 盒与 Ｃ ｃｐ 、 Ａ ＡＡＴ盒 ， 推测病 毒启 动
子 区 域 位 于 Ｕ３区 内 ， Ｕ３区 还 存 在 ３ ｐ重 复 序 在 ９ｂ
２ ８个 有 效 的 顺 式 作 用 元 件 ， 测 这 些 元 件 对 Ｐ Ｒ 的 转 录 起 着 或 正 或 负 的 调 控 作 用 。 本 试 验 获 得 的 推 Ｅ Ｖ
Ｐ Ｒ Ｂ亚型 ５ｕＴ Ｅ Ｖ－ Ｒ序 列对 进一 步研 究广西 巴马小型猪 Ｐ ＲＶ— Ｅ Ｂ亚型病 毒 的转录调控 机制 奠定 了基 础 。
７ Ｃ １ ｎ ２。 ０ｍｉ 。取 第 ｌ轮 Ｐ Ｒ 产 物 １ ０ Ｌ， 去 离 Ｃ ． 用
子 水稀 释 ５ ０倍 后 ， 中取 ２ Ｌ作 为 第 ２轮 Ｐ Ｒ的 从 Ｃ
模 板 ， 系 与 第 １轮 Ｐ Ｒ 相 同 ， 物 用 Ｐ ＵＴＲ 体 Ｃ 引 Ｓ ２和 ＮＵＰ 程 序 为 ：４ 。 ５ｍｉ ； ４ ℃ ３ ， ８ ℃ ４ ， ， ９ Ｃ ｎ９ ０ｓ５ ５ｓ ７ ℃ ２ ｍｉ ， ２ 个 循 环 ； 后 ７ ℃ １ ｉ。 用 ２ ｎ ３ 最 ２ ０ｒ ｎ ａ １ ／ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 扩 增 结 果 。 ０ｇ Ｌ １２ ６ 克 隆测序 ．． 将 上 述 Ｐ Ｒ 产 物 胶 回 收 之 后 与 Ｃ ｐ Ｄ１ 一 载 体 连 接 ， 化 入 ＤＨ５ Ｍ ８Ｔ 转 ａ感 受 态 细 胞 ， 再 经 过 菌 液 Ｐ Ｒ 以 及 质 粒 酶 切 鉴 定 正 确 后 ， 北 京 诺 Ｃ 送
欧 阳康 等 ： 西 巴 马 小 型 猪 内源 性 反 转 录 Ｂ亚 型 病 毒 ５非 编 码 区 的序 列 扩增 及 分 析 广
Ｚ ５
技 发展 中 心 。
１ ２ 方 法 ．
Ｐ Ｒ， 序 为 ：４ 。 ｎ ９ Ｃ 程 ９ Ｃ ５ｍｉ； ４℃ ３ ， １℃ ４ ， Ｏｓ ６ ５ｓ 每
Ｐ ＲＶ－ ＵＴ 对 进一 步研究病 毒转 录调 控机制 、 Ｅ ５ Ｒ， 构
制并且垂 直传播 的 Ｐ Ｒ 病毒 颗粒［ 。 Ｅ Ｖ ４ ］
Ｐ Ｒ 基 因组 为 单 股 、 链 、 性 ＲＮＡ 二 聚 Ｅ Ｖ 正 线
含 了 两 端 的 ５、 编 码 区 （ ｎ ｒｎｌｔｄ ｒｇｏ ， ３非 ｕ ｔａ ｓａｅ ｅ ｉｎ ＵＴＲ 和 ｇ ｇ ｐ ｌｅ Ｖ３个 结 构 基 因 。根 据 ｅ ｖ基 ） ａ 、 ｏ 、ｌ ＇ ｉ ｎ
建 感染性 克 隆具 有 重要 意 义 ， 时 还 为异 种 移植 供 同
考。
体， 单体 长约 ７ｂ ～ ９ｋ 。完 整 的 Ｐ ＲＶ前 病 毒包 体 的选 择 以及 我 国小 型 猪 资 源 的开 发 利 用 提 供 参 ｐ ｂ Ｅ
ｌ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 ．
因受 体结合 区的差 异 Ｐ Ｒ 可 以 分为 Ｐ ＲＶ Ａ、 Ｅ Ｖ Ｅ — Ｂ、 Ｃ三个 亚型 ， 中 Ａ、 其 Ｂ亚型 能 够感 染人 和 猪 的细胞 系， Ｃ亚型在人 源细胞 中不 能 复制 ， 是可 以感 染猪 但 源细胞 系 。Ｐ ＲＶ ５ ＵＴＲ 由 ３ 独 特 区 （ ） 末 ］ Ｅ － Ｕ３ ，
欧 阳康 吴健 敏 ， 一， 陈凤 莲 马 玲 刘 文娟 白安斌 郭 亚 芬 ， ， ， ，
（． 西 壮 族 自治 区 兽 医 研 究 所 ， 西 南 宁 ５ ００ ；． 西 大 学 动 物 科 学技 术 学 院 ， １广 广 ３０１２广 广西 南 宁 ５０ ０ ） ３ ０ ５
摘 要 ： 应用 Ｓ ＭＡＲ Ｃ Ｔ ＲＡ Ｅ方 法快速扩 增广 西 巴马 小型猪 内源性反 转 录病毒 （ Ｅ Ｖ） Ｐ Ｒ ５非编 码 区 ， 获
复 制 口 ， 猪 基 因 组 中存 在 ５ ］在 ０个 拷 贝 数 左 右 可 以复
广西 巴马小 型猪是 由长期 近亲 交配 形 成 的封 闭 群体 ， 具有 体型 小 、 传稳 定 、 粗 料 等 国外 小 型 猪 遗 耐 不可 比拟 的优点 ， 具有 作 为异 种 移 植 良好供 体 的潜 能 。本 研究 以广 西 巴 马小 型 猪 为材 料 ， 克隆 分 析其
列 ，Ｅ Ｐ ＲＶ启 动 子 的 活性 随 着 ３ ｂ 重 复 次 数 的增 ｐ ９
收 稿 日期 ： ０ ００ — ８ ２ １ — ６０ 基 金 项 目： 西 青 年 科 学基 金 项 目（ 科 青 ０ ３ ０ ８ ； 广 桂 ８ ２ ６ ） 家畜 疫 病 病 原 生 物 学 国 家重 点 实验 室 开 放 基 金 ； 西 研 究 生教 广 育 创 新 计 划 资助 项 目（ Ｏ ９ Ｏ Ｏ Ｏ ３ １５ ３ ９ ３ ９ ） 作 者 简 介 ： 阳 康 （ ９ ５ ） 男 ， 西 恭城 人 ， 士研 究 生 ， 要 从 事动 物 传 染病 与 分 子 免 疫 学研 究 。 ＊通 讯 作 者 欧 １８一 ， 广 博 主
得 了一条 长度 为 １４ ３ｂ ２ ｐ的 Ｐ Ｒ ５ＵＴ Ｅ Ｖ－ Ｒ序 列 （ ｎ ａ ｋ登 录 号 Ｇ ９ ２ １ ， Ｇｅ Ｂ ｎ Ｕ３ ０ ３ ） 该序 列 与 Ｇ ｎ ａ ｋ已发 表 ｅＢ ｎ
的Ｐ ＥＲｖ＿ Ｂ、 各 亚 型 同 源性 分 别 为 ９ ． ～９ ． 、 １ ８ ～ ９ ． 和 ８ ． ～ ９ ． ， 传 进 化 树 分 Ａ、 Ｃ ２４ ５ ２ ９ ． ９５ ６５ ２６ 遗
（ Ｂ ） 前 导 序 列 （ ｅｄ ｒ 组 成 。其 中 Ｓ ｈ ｅ 转 录酶 Ｐ ｉ Ｓ ｒｐ、 ＰＳ 和 Ｌ ａｅ） ｃ ｅ ｆＧ ｒ ｍｅ ｃｉｔ限制性 内切酶 Ｅ ｏ ＺＩ、 ｃ Ｒ Ｉ、
ｐ ＭＤ１ 一 载体 、 Ａ Ｔ ｑＴ ＮＡ 聚合 酶均 购 自宝生 ８Ｔ Ｌ ａ Ｍ Ｄ 物 工程 （ 连 ） 限公 司 ； ＮＡ分 离 纯化 试剂 盒购 大 有 ｍＲ 自 Ｐ ｏ ｇ 公 司 ； 剂 量琼 脂 糖 凝 胶 回 收试 剂 盒 ， ｒｍｅ ａ 小 质粒 Ｄ ＮＡ 小 量纯化 试剂 盒购 自北 京博 润 德 生物 科
Ｓ Ａ Ｒ Ｔ— （ ） Ａ Ａ ＧＣＡ Ｇ ＴＧ Ｇ Ｔ Ａ ＴＣＡ Ａ ＣＧ Ｃ Ａ Ｇ Ａ ＧＴ Ａ ＣＧ ＣＧ ＧＧ Ｍ Ａ １ ０
ｘ ． ３软件 进 行 序 列 的 比对 ， ＡＳａ 软 件 进 行 同 １８ ＤＮ ｔｒ 源性 分析 ， 构建 遗传 进 化树 使用 ＭＥ Ａ４软件 ， 控 Ｇ 调
动 物 医 学 进 展 ，Ｏ ｌ３ （ ） ２ ８ ２ ｌ ，２ １ ：４２