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名词解释：第一章基因组遗传图（连锁图）：指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离。
单位是厘摩cM （基因或DNA片段在染色体交换过程中分离的频率）。
物理图：以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-tagged site, STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。
转录图：以EST（expressed sequence tag ，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。
EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500 bp左右。
序列图（分子水平的物理图）：序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图。
既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。
基因：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA序列，即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。
基因组（genome）：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质的总和。
基因组学（genomics）：涉及基因组作图、测序和整个基因组功能分析的一门学科。
C值：单倍体基因组的DNA总量，一个特定种属具有特征C值C值矛盾（C value paradox）：指一个有机体的C值和其编码能力缺乏相关性。
单一序列：基因组中单拷贝的DNA序列。
重复序列：基因组中多拷贝的DNA序列。
复杂性（complexity）：基因组中不同序列的DNA总长。
高度重复序列（highly repetitive sequence）：重复片段的长度单位在几个到几百个碱基对（base pair，bp）之间（一般不超过200 bp），串联重复频率很高（可达106以上），高度重复后形成的这类重复顺序称为高度重复顺序。
中度重复序列（intermediate repetitive sequence ）：重复长度300～7000 bp不等，重复次数在102～105左右。
农垦58S 光敏不育基因突变位点的确定及pms 3区间的进一步作图3梅明华 陈 亮33 章志宏333 李子银3333徐才国 张启发33333(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉430070)摘要 光敏核不育水稻农垦58S 系由正常晚粳品种农垦58自然突变产生.以农垦58S 与农垦58杂交F 2为材料作RF LP 分析,确定了原始光敏不育基因突变位点为位于第12染色体上的pms3,即由正常品种农垦58变为光敏不育农垦58S 是pms3上基因突变的结果.还对(农垦58S ×1514)群体做了大量的RAPD 和AF LP 分析,找到并定位了4个与pms3连锁的标记,增加了该区间的分子标记密度.关键词 光敏核不育水稻 基因定位 限制性片段长度多态性(RF LP) 随机扩增多态性DNA(RAPD) 扩增片段长度多态性(AF LP)光敏核不育水稻农垦58S (简称58S )是1973年从晚熟粳稻(Oryza sativa ssp.japonica )品种农垦58(简称58N )中发现的自然突变株[1].该水稻具有在长日条件下不育、短日条件下可育的特点,因而可在短日条件下作不育系的繁殖,在长日条件下用于杂种种子生产.从而为“两系”法杂交稻的培育提供了材料.对于光敏核不育性的遗传已有大量的研究.对数十个杂交组合的分析表明,58S 与大多数粳稻品种杂交,后代育性表现为2对孟德尔基因的分离[2];而58S 与58N 杂交,后代育性表现出1对孟德尔基因的分离[3].因此推测58S 系58N 单基因突变的结果.对光敏不育基因的定位也有报道.张端品等用形态标记基因系的定位分析,认为58S 的一对光敏不育基因与第5染色体上的标记基因大黑矮生(d 21)连锁[4].Zhang 等以58S 转育而成的籼型光敏核不育系32001S 与品种明恢63杂交F 2为作图群体,以RF LP 分子标记进行分析,确定了第3,7染色体上各有一个控制育性的基因位点,且位于第7染色体基因(pms1)的效应远大于第3染色体上的基因(pms2)[5].王风平等人[6]利用与pms1连锁的分子标记对58S 与58N 杂交组合F 2随机群体作RF LP 分析的结果表明,由58N 变为光敏不育的58S 的突变 1998203223收稿,1998210229收修改稿 3国家“八六三”高技术计划和美国洛克菲勒基金会资助项目 33现在厦门大学生物系333工作单位武汉大学生命科学院3333现在中国科学院遗传研究所33333联系人中 国 科 学 (C 辑) 第29卷 第3期SCIE NCE I N CHI NA (Series C ) 1999年6月基因不在pms1区段,即58N 变为58S 不是pms1突变的结果.最近,Mei 等人[7]以58S 分别与“轮回422”和“1514”杂交组合F 2群体为材料作RF LP 分析,确定了在这2个组合中控制光敏不育性的除位于第7染色体上的pms1位点外,还有一个位于第12染色体的新位点(pms3). 仍然不清楚的是:由58N 变为58S 是哪个位点基因突变的结果?本研究确定了由58N 变为58S 的原始光敏不育突变的基因位点,并进一步增加了此位点所在的染色体区段上的分子标记.研究结果为光敏不育基因的高效利用提供了条件,为该基因的分离克隆奠定了基础.1 材料与方法111 实验群体及育性考察实验材料为以58S 分别与“1514”和58N 杂交获得的F 2群体.58S 来源于原始光敏核不育水稻种子,“1514”是从培C115中系统选育而成的粳稻品种.将亲本和F 2群体于1995～1997年水稻生长季节在武汉自然长日条件下种植,以自然结实率和花粉深染率为指标考察育性,并对不育株鉴定短日条件下育性转换特性.112 DNA 抽提和极端集团的制备从田间生长的植株上收获新鲜叶片,采用CT AB 法[8]抽提DNA.从各F 2群体中选取10个高度可育和10个高度不育单株分别组建可育集团和不育集团,供筛选与光敏不育基因连锁的RF LP ,RAPD 和AF LP 标记之用.113 分子标记分析11311 RAPD 分析 随机扩增多态性DNA (RAPD )分析共用引物1047个,其中1010个购自美国Operon 公司(OPA ～OPZ 系列引物490个,OPAA ～OPAZ 系列引物520个),37个(RA 系列)为本室自己合成.按William 等人[9]的方法将所有1047个引物对(58S ×1514)杂交组合F 2可育集团和不育集团作单引物RAPD 分析,还以本室合成30个引物和9个Operon 引物组成710对引物组合作双引物RAPD 分析.于紫外灯下从凝胶中切出在可育集团和不育集团间表现出特异扩增的DNA 片段(阳性片段),用Pharmacia 公司Sephaglas T M bandprep kit 回收,Invitrogen original T A cloning kit 克隆.11312 AF LP 分析 扩增片段长度多态性(AF LP )分析共选用了266对Eco R Ⅰ+3和Mse Ⅰ+3的引物,AF LP 反应参照Vos 等人[10]方法进行.简述如下:取1.25μg 水稻总DNA 用Eco R Ⅰ(5U )和Mse Ⅰ(5U )消化,将消化产物与限制性内切酶接头(adapter )连接,用磁珠吸附Eco R Ⅰ酶切片段,以Eco R Ⅰ+1和Mse Ⅰ+1引物作预扩增,扩增产物即为AF LP 反应模板.对模板用Mse Ⅰ+3和[γ232p ]ATP 标记的Eco R Ⅰ+3进行选择性扩增,将扩增产物作聚丙烯酰胺变性凝胶电泳,烘干胶,放射自显影.对扩增出现的阳性片段,根据X 光片上的位置从胶中挖出DNA ,用原引物再作PCR 扩增,琼脂糖凝胶电泳,以Sephaglas T M bandprep kit 回收,用5′Prime 23′Prime 公司的G eneral contractor T M DNA cloning system kit 克隆.11313 RF LP 分析 每样本取2.5μg 总DNA ,用6～21种限制性内切酶消化.DNA 的消化、电泳、转膜和分子杂交均参照本室实验方法进行[11].第3期梅明华等:农垦58S 光敏不育基因突变位点的确定及pms3区间的进一步作图311 2 结果211 58S光敏不育突变基因位点及遗传效应图1 长日条件下(N ongken 58S ×58N )组合F 2群体的育性分布(武汉,1995)21111 58S 与58N 杂交F 2群体育性分离 在1995年武汉自然长日条件下,173株的育性呈不连续分布(图1),可育株(自然结实率>45%)和不育株(自然结实率<20%)呈典型的单基因遗传分离(χ2=0.002,P >0.90).于1997年对该组合120株群体育性分离再次考察得到了类似结果(χ2=0.011,0.75<P <0.90).这种典型的单基因分离与已有报道完全一致[2,3].21112 58S 光敏不育突变基因位点的确定 Mei 等人1)从康乃尔大学和日本水稻基因组计划(RG P )已发表的2张水稻高密度分子标记连锁图[12,13]上选了306个RF LP 探针,对(58S ×1514)和(58S ×轮回422)2个F 2群体的极端集团分析共鉴定出33个阳性标记,其中9个来自第7染色体,24个来自第12染色体,与这些标记连锁的光敏不育基因分别为pms1和pms3.前已提及,王风平等人[6]的研究结果表面58S 与58N pms1位点上的等位基因相同.图2 光敏不育pms3位点在分子标记连锁图上的位置F3,V4为用AF LP 技术获得的标记,A U1021500,R A27+R A322300为用R AP D 技术所获得的标记.其余为RF LP 标记,其位置参照M ei 等人[7]为了确定58S 突变基因的位置,将上述源于第12染色体的全部阳性标记与经21种限制性内切酶消化的58S 与58N 亲本DNA 作RF LP 分析发现,R2708和R643两个探针与Dra Ⅰ,Bgl Ⅱ和Sca Ⅰ等限制性内切酶组合可揭示58S 与58N 之间多态性,R2708检测的带型表现共显性,而R643呈显性(58N有带,58S 无带).用这些探针/酶组合分析(58S ×58N )F 2群体的2个极端集团,检测到极端集团间的多态性,表明引起58S 与58N 间育性分离的基因位点与R2708和R643连锁.将R2708和R6432个标记对(58S ×58N )F 2群体中选出的极端不育株作RF LP 分析,在37个不育株中,R2708检测到7株杂合,R643检测也仅这7株有带.由于R2708和R643B 在RG P 图中位置相同[13],我们推测R643检测到的这7棵有带植株也是杂合体,即2个标记位点在37株中呈共分离.以极大似然法[14]计算得2个标记位点与第12染色体上不育基因的距离均为9.56cM ,该值与用(58S ×1514)F 2算得的结果(1995年数据为9.54cM ,1996年数据为8131cM )一致[7].据此我们推测,引起(58S ×58N )组合育性分离的位点即为我们以前所鉴定的pms3位点,其位置如图2所示.312 中 国 科 学 (C 辑)第29卷21113 pms 3的效应分析 按R2708位点3种RF LP 基因型分组,对(58S ×58N )F 2群体120株的育性考察结果进行了单因子的方差分析,结果表明,以自然结实率和花粉深染率为育性指标,R2708位点3种基因型间育性差异均达极显著水平(表1).进一步将3种基因型的育性平均值(表2)比较可以看出,R2708标记位点为58S 带型纯合的基因型育性很低,该位点为58N 带型纯合的基因型高度可育,而杂合基因型则为半可育.还应指出的是,由于标记与育性基因的距离较远而发生交换,上述分析比较显然低估了该基因的效应.表1 用与pms3连锁的R2708分子标记基因型分组对(58S ×58N )F 2群体育性作单因子方差分析a )育性指标效应均方误差均方F P 花粉育性38816.52754.1651.470.0001自然结实率42656.5401.70106.120.0001 a )效应自由度为2,误差自由度为117表2 按R2708标记基因型分组估算pms3育性基因位点在(58S ×58N )F 2群体(120株)的遗传效应a)R2708基因型株数花粉深染率/%(平均值±标准差)自然结实率/%(平均值±标准差)112811.40±27.577.73±17.51125761.06±29.1359.48±23.85223580.24±24.3880.03±14.20 a )11,58S 带型纯合体;22,58N 带型纯合体;12,杂合体212 pms 3区段的进一步作图由于在以前的研究中我们已经用尽了从2张分子标记连锁图上所能获得的RF LP 标记,但pms3区段上的标记仍很稀疏[7],我们进行了大规模的RAPD 和AF LP 分析.21211 RAPD 筛选 在对(58S ×1514)组合进行RAPD 分析的1047个单引物中,有8个引物在可育集团和不育集团中扩增出多态性片段;在对此组合进行RAPD 分析的710对双引物中,筛选到6对引物在2个集团之间扩增出多态性片段.将上述阳性片段回收、克隆作RF LP 探针,与6种限制性内切酶消化的该组合的2个极端集团及其亲本杂交作RF LP 分析,结果表明,OPAU1021500和RA27+RA322300两个克隆检测的RF LP 可能与光敏不育基因连锁.其余RAPD 片段克隆作RF LP 探针,在亲本间检测不到多态性.21212 AF LP 筛选 在对(58S ×1514)组合2个集团及其亲本进行筛选的266对AF LP 引物中,253对扩增出清晰可读的带,每对引物平均扩增出可读带约40条.230对引物在亲本间扩增出多态性带,其中有20对引物在2个集团中扩增出差异,并相应地获得了20个阳性克隆.以这些阳性克隆作RF LP 分析,12个克隆为单拷贝或低拷贝,4个克隆为多拷贝,4个克隆为重复序列.将12个单拷贝或低拷贝克隆再次做RF LP 分析,6个克隆在亲本间检测到多态性,其中2个克隆(编号F3和V4)在2个集团之间呈现差异,即可能与光敏不育基因连锁.21213 阳性片段与光敏不育基因位点的距离 用上述由RAPD 和AF LP 分析获得的阳性标记分析1995年考察的(58S ×1514)组合F 2中的52个极端不育株,按Zhang 等人[5]的方法根据极端不育株中标记基因型计算各标记位点与光敏不育基因的遗传距离(表3).根据52个不育株中的重组推测,这4个克隆片段均与pms3连锁,并位于该基因位点的同侧(图2).第3期梅明华等:农垦58S 光敏不育基因突变位点的确定及pms3区间的进一步作图313 表3 利用(58S ×1514)F 2群体中高度不育株估算RAPD 和AF LP 标记与第12染色体上光敏不育基因(pms3)之间的遗传距离分子标记交换值/%遗传距离/cM AU10215009.61±2.899.73RA27+RA32230018.27±3.7919.15F35.77±2.28 5.80V 47.69±2.617.753 讨论本研究的主要结果是确定了原始光敏不育基因突变位点为位于第12染色体上的pms3,即由正常品种58N 变为光敏不育的58S 是pms3上基因突变的结果.用58S 与58N 配组作光敏不育基因定位难度较大.因为从理论上讲,58S 是58N 单个位点突变的产物,二者应仅在光敏不育基因突变位点有差异,而基因组的其余部分相同.但实际上,58S 和58N 在株高、生育期等性状上存在明显差异,原因是,在长期种植过程中,正常品种58N 产生了多种变异类型,用RF LP 分析可检测到多条染色体上DNA 多态性[6],从而使本研究得以用58S ×58N 组合分析定位突变基因pms3.目前已报道的光敏不育基因定位已涉及到第3,5,7和12等染色体[4,5,7].然而,在绝大多数杂交后代中,育性表现为1对或2对主基因的分离[2,3].看来,不同的不育系中光敏不育基因位点可能很不相同.例如,尽管32001S 是以58S 作为不育基因供体培育而成的,但根据现有分析结果,二者的育性位点就有较大的差别:58S 中位于第7染色体上的不育基因与32001S 中的不育基因位点pms1相同,但是32001S 在第12染色体上不存在与58S 相应的不育基因[5],而在32001S 中发现的第3染色体上的不育基因pms2,在58S 却检测不到[7].还有证据表明32001S 在第12染色体上pms3区段的基因型与58S 不同而与其籼稻亲本相同(本室未发表的结果),58S 第12染色体上的不育基因并未导入到32001S 中去.另外,(32001S ×明恢63)组合在第3染色体上pms2区域存在严重的偏分离现象[5].因此我们估计这一不育基因可能与籼粳杂交有关.因此,同为两位点的遗传行为,涉及到的位点却不相同.以58S 为供体培育光敏不育系并不意味着58S 中的2对不育基因的全套转移,新的不育系甚至可以不要原始的光敏不育突变基因本研究的另一个主要目的是进行pms3区间的进一步作图.pms3的位置在康乃尔和RG P 图上均为标记稀疏区域.尽管我们进行了大规模的RAPD 和AF LP 分析,也得到了不少的多态性扩增片段,但将其转换为RF LP 后所获得的阳性标记不多.所得到的阳性标记虽然使该区间附近的标记密度有所增加,但没有一个标记较已定位的RF LP 标记与pms3的连锁更为紧密,pms3区间仍旧是标记稀疏区域.看来此区段上单拷贝序列不多,这是进一步研究作该基因的分离克隆所需要解决的.参 考 文 献1 石明松.对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现与初步研究.中国农业科学,1985,5(2):44～48314 中 国 科 学 (C 辑)第29卷2 靳德明.光敏核不育性的遗传基础.见李泽炳等主编.光敏感核不育水稻育性转换机理与应用研究,武汉:湖北科学技术出版社,1995.181～2523 梅明华,李泽炳.粳稻品种中掩盖光敏核不育性的主效恢复基因分析.作物学报,1995,21:95～1014 张端品,邓训安,余功新,等.农垦58S 光敏感雄性不育基因的染色体定位.华中农业大学学报,1990,9:407～4195 Zhang Q ,Shen B Z ,Dai X K,et ing bulked extremes and recessive class to map genes for photoperiod sensitive genic male sterility in rice.Proc Natl Acad Sci US A ,1994,91:8675～86796 王风平,梅明华,徐才国,等.光敏不育水稻农垦58S 与正常农垦58在pms1区段无育性基因分离.植物学报,1997,39:922～9257 M ei M H ,Dai X K,Xu C G,et al.M apping and genetic analysis of the genes for photoperiod sensitive male sterility in rice using the original mutant N ongken 58S.Crop Sci ,in press8 Murray M G,Thom ps on W F.Rapid is olation of high m olecular weight plant DNA.Nuc Acids Res ,1980,8:4321～43259 W illiam A ,S tephen J S ,R obert W F ,et al.DNA polym orphisms am plified by arbitrary primers are useful genetic markers.Nuc Acids Res ,1990,18:6531～653510 V os P ,H ogers R ,Bleeker M ,et al.AF LP :a new technique for DNA fingerprinting.Nuc Acids Res ,1995,23:4407～441411 Liu K D ,W ang J ,Li H B ,et al.A genome 2wide analysis of wide com patibility in rice and the precise location of the S 5locus in them 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