以黄嘌呤氧化酶为靶点的新型非嘌呤类抗痛风及高尿酸血症药物研究进展

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810609568.1(22)申请日 2018.06.13(71)申请人 四川理工学院地址 643000 四川省自贡市汇兴路学苑街180#(72)发明人 左之利　彭佳乐　刘兴勇　张利　张树群　孙威　周业珩　(74)专利代理机构 重庆博凯知识产权代理有限公司 50212代理人 李海华(51)Int.Cl.A61K 31/53(2006.01)A61K 31/4439(2006.01)A61K 31/4709(2006.01)A61K 31/4365(2006.01)A61K 31/427(2006.01)A61P 19/06(2006.01)(54)发明名称化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用及治疗抗痛风、抗高尿酸血症的药物组合物(57)摘要本发明公开了化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用及治疗抗痛风、抗高尿酸血症的药物组合物，该类化合物具有如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示的通式结构。

本发明所提供的一系列具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的化合物在制备治疗抗痛风、抗高尿酸血症药物中的应用，经过体外酶活性实验，证明其有明显的黄嘌呤氧化酶(XO)抑制作用。

权利要求书3页 说明书7页CN 108853112 A 2018.11.23C N 108853112A1.具有通式I的化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用，所述通式I如式I所示：其中，R1基团为R2基团为R3基团为R4基团为或者R3R4为：2.根据权利要求1所述的具有通式I的化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用，所述通式I所示化合物为3.具有通式Ⅱ的化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用，所述通式Ⅱ如式Ⅱ所示：其中，R1基团为R2基团为4.根据权利要求3所述的具有通式Ⅱ的化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用，所述通式Ⅱ所示化合物为5.具有通式Ⅲ的化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用，所述通式Ⅲ如式Ⅲ所示：其中，R1基团为R2基团为6.根据权利要求5所述的具有通式Ⅲ的化合物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用，所述通式Ⅲ所示化合物为7.一种治疗抗痛风、抗高尿酸血症的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-6任一所述的化合物，或者该化合物在药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

山东大学博士学位论文高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选姓名：刘文波申请学位级别：博士专业：内科学（风湿病学）指导教师：李兴福20080420山东大学博士学位论文符号说明英文缩写ＸＯＤＣＯＸ英文全称ｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｃｙｃｌｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ．１中文全称黄嘌岭氧化酶环氧化酶白细胞介素１Ｂ肿瘤坏死因子Ｑ微晶型尿酸钠ＩＬ—ｌｐＴＮＦ．ａＢｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ．ｎＭＳＵＵＡＯＡＮＳＡＩＤｓｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｕｒａｔｅｃｒｙｓｔａｌｕｒｉｃａｃｉｄｏｘｏｎｉｃａｃｉｄＮｏｎ．ｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ．．尿酸氧嗪酸非甾体抗炎药ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇＬＴＰＧＩｇＩｐｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａＩｉｎｏｓｉｎｅ白细胞三烯前列腺素灌胃给药腹腔注射次黄嘌呤核苷酸５一磷酸核糖一１一焦磷酸花生四烯酸质量／电荷，质荷比表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术ｉｎｊｅｃｔｉｏｎＩＭＰＰＲＰＰｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ５一Ｐｈｏｓｐｈｏｒｂｏｓｙｌ—ｌ－ｐｙｒｏｐｈｏｓ—ｐｈａｔｅＡＡａａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄＭ／ＺＳＥＬＤＩ．ＴＯＦＭＳＭａｓｓ／ＣｈａｒｇｅＳｕｒｆａｃｅｅｎｈａｎｃｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｌｌ原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本声明的法律责任由本人承担。

论文作者签名：翻童遗Ｅｌ期：矽扎５．矽关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。

非布司他产品名称：非布索坦产品别名：非布司他英文名称：FebuxostatCAS 编号：144060-53-7中文同义词: 2-[3-氰基-4-异丁氧基苯基]-4-甲基噻唑-5-甲酸;非布索坦，非布司他[外观 ] : 白色粉末用途治疗尿酸过高症(痛风)一、项目概况1、开发品种：非布佐司他原料、片剂2、申报类别：原料及制剂均为化学药品3.1类3、规格：40mg、80mg两个规格。

4、适应症：本品为黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂，适用于具有痛风症状的高尿酸血症的治疗。

适应用于已出现尿酸沉积(包括痛风石、痛风性关节炎)的慢性高尿酸血症的长期治疗。

5、用法用量：用于治疗有痛风症状的高尿酸血症患者时，推荐本品剂量为40mg或80mg，每日一次。

6、市场价格(最高限价、中标价)：国内：无。

国外：174.99美元/盒(40mg，30片)，184.49美元/盒(80mg，56片)二、项目特点近年来，痛风已经成为一种发病率越来越高的富贵病。

从医院临床的调查情况来看，无论是专科医生还是内科医生对这一类疾病的警惕性都比较高。

消费行为调查显示，虽然痛风预防的常识普及远不及高血压、冠心病深入人心，但是普通老百姓大多熟知该病的发病特点和诱发因素，只是对其远期危害(例如对肾功能的严重破坏等)知之甚少。

饮食是诱发痛风的重要因素，但是受传统饮食文化的影响，即使对于高发人群来悦，酗酒、吃海鲜等饮食习惯也很难纠正。

而临床医生近年来对痛风这一疾病的临床用药态度，较几年前更为重视和慎重。

抗痛风药物主要是临床用药，从目前医院抗痛风制剂的销售数量与销售金额来看，近两年这类药物的销售均呈现大幅上扬趋势，并呈现出夏秋季高发的季节性特点，这与流行病学发病高峰时间上的分析基本一致。

抗痛风药目前品种不多，临床治疗主要以秋水仙碱、非甾体类抗炎药、激素、促进尿酸排泄药(如丙磺舒、磺吡酮及苯溴马隆)和抑制尿酸合成药(别嘌呤醇)为主。

这些药物在治疗上都有缺陷。

疗效差、副作用大成为其临床应用的瓶颈。

非布司他说明书非布司他主要成份为非布佐司他，其化学名为2-[(3-氰基-4-异丁氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑羧酸。

为黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂，适用于具有痛风症状的高尿酸血症的长期治疗。

基本信息中文名称:非布司他别名:非布佐司他、非布索坦（通用名称）汉语拼音FeibuzuositaPian 外文名称:Febuxostat Tablets药品名称:非布司他成份本品主要成份为非布佐司他，其化学名为2-[(3-氰基-4-异丁氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑羧酸。

结构式:分子式:C16H16N2O3S分子量:316.37性状本品为白色粉末适应症适用于具有痛风症状的高尿酸血症的长期治疗。

不推荐本品用于治疗无症状性高尿酸血(症)。

剂型胶囊剂、片剂规格40mg/粒或片;80mg/粒或片用法用量推荐剂量用于治疗有痛风症状的高尿酸血症患者时，推荐本品剂量为40mg或80mg，每日一次。

推荐本品的起始剂量为40mg，给药本品时无需考虑食物或抗酸剂的影响。

特殊人群轻或中度肾功能损伤患者服用本品时不必调整剂量。

推荐本品的起始剂量为40mg，每日一次。

给药剂量40mg，持续两周后，对血清尿酸水平(sUA)仍高于6 mg/dl的患者，推荐给药剂量80mg。

轻中度肝功能损伤患者服用本品无需剂量调整。

对严重肝功能损伤患者使用本品尚无研究，因此给药本品应谨慎。

尿酸水平使用本品治疗2周后即可进行血清尿酸的再检验。

治疗目标是降低和维持血清尿酸水平使其低于6 mg/dl。

预防痛风急性发作推荐至少用药6个月(见【注意事项】)。

痛风发作变化的血清尿酸水平会导致沉积的尿酸盐活动，因此开始给药本品后会导致痛风发作。

推荐使用本品时，同时给药非甾体抗炎药(NSAID)或秋水仙碱，以预防痛风发作。

预防痛风急性发作推荐至少用药6个月。

如果在给药治疗期间发生痛风，不需要停药。

对个别患者的痛风应相应给予治疗。

续发性高尿酸血症对继发性高尿酸血症患者(包括器官移植患者)给药本品尚无研究;尿酸盐生成率增加的患者不推荐使用本品(例如恶性病及其治疗、莱-萘二氏综合征)。

痛风的治疗进展武东;刘湘源【摘要】痛风已是危害人们健康的常见疾病，近些年在痛风的诊治方面取得了很大的进展，本文主要就痛风的治疗，包括急性痛风性关节炎，降尿酸治疗和急性痛风的预防性治疗等方面进行介绍。

急性痛风发作时应给予积极抗炎镇痛治疗，病情严重者可给予联合治疗。

急性发作期在给予抗炎治疗的同时可给予降尿酸治疗，不影响急性发作的缓解。

除非布司他可有效降低血尿酸外，新型降尿酸药物lesinurad 有望与非布司他或别嘌醇联合应用，达到更好的降尿酸效果。

%ABSTRACT:Gout has already become a common disease endangering people's health.In recent years,great progresses have been achieved in the treatment of gout.The review focuses on the advances in the treatment of gout, including acute gouty arthritis,uric acid lowering treatment,the prophylactic treatment of acute gout flares and so on. A positive anti-inflammatory treatment should be given to the patients with acute gouty arthritis,and severe cases may be given combination therapy.Studies have confirmed that the uric acid lowering treatment combined with anti-inflammatory drugs can be given to the patients with gout flare,which will not affect the remission of gout flares. Besides febuxostat,which can effectively lower blood uric acid,lesinurad,as a new uric acid lowering drug,can be expected to obtain better effect in lowering uric acid when combined with febuxostat or allopurinol.【期刊名称】《临床荟萃》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】3页(P1344-1346)【关键词】痛风;体征与症状;诊断;治疗【作者】武东;刘湘源【作者单位】北京大学第三医院老年内科，北京 100191;北京大学第三医院风湿免疫科，北京 100191【正文语种】中文【中图分类】R971.1痛风是由单钠尿酸盐(MSU)沉积于关节及周围软组织所致的晶体性关节炎，与高尿酸血症相关。

㊀基金项目:辽宁省自然科学基金(Ｎｏ.２０１５０２０６９４)㊀作者简介:韩慧璞ꎬ女ꎬ研究方向:中药药效物质基础ꎬＥ－ｍａｉｌ:５１７９６０１０６＠ｑｑ.ｃｏｍ㊀通信作者:张明波ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ副教授ꎬ研究方向:药物虚拟筛选ꎬＴｅｌ:０４１１－８５８９０４１０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｍｂｚｈａｎｇ＠１２６.ｃｏｍ茵连痛风颗粒中黄嘌呤氧化酶抑制剂的虚拟筛选韩慧璞１ꎬ徐志立１ꎬ李莉１ꎬ王月丹２ꎬ初明２ꎬ张明波１(１.辽宁中医药大学药学院ꎬ辽宁大连１１６６００ꎻ２.北京大学医学部基础医学院ꎬ北京１００１９１)摘要:目的㊀探究中药复方茵连痛风颗粒中对黄嘌呤氧化酶有抑制作用的活性成分ꎮ方法㊀依据文献报道ꎬ建立了茵连痛风颗粒中所含化合物的结构数据库ꎻ以黄嘌呤氧化酶为靶标ꎬ使用ＡｕｔｏＤｏｃｋＶｉｎａ软件对这些化合物进行虚拟筛选ꎬ并用ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌ对代表性活性成分与黄嘌呤氧化酶的作用模式进行了分析ꎮ结果㊀茵连痛风颗粒所含物质中有１３个化合物与黄嘌呤氧化酶的结合能在－９.０ｋｃａｌ ｍｏｌ－１以下ꎬ其中主要为黄酮类成分ꎮ结合模式分析表明这些活性分子可以与黄嘌呤氧化酶的活性位点形成－相互作用㊁疏水相互作用和氢键相互作用ꎮ结论㊀茵连痛风颗粒中含有黄嘌呤氧化酶抑制剂ꎬ可通过降低尿酸的生成发挥抗痛风作用ꎮ关键词:痛风ꎻ尿酸ꎻ黄嘌呤氧化酶ꎻ虚拟筛选中图分类号:Ｒ２８４㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０５－０２６９－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０５.００５ＶｉｒｔｕａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎＹｉｎｌｉａｎＧｏｕｔＧｒａｎｕｌｅｓＨＡＮＨｕｉｐｕ１ꎬＸＵＺｈｉｌｉ１ꎬＬＩＬｉ１ꎬＷＡＮＧＹｕｅｄａｎ２ꎬＣＨＵＭｉｎｇ２ꎬＺＨＡＮＧＭｉｎｇｂｏ１(１.ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＬｉａｏｎｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＤａｌｉａｎ１１６６００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１００１９１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ(ＸＯＤ)ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｏｆＹｉｎｌｉａｎＧｏｕｔＧｒａｎｕｌｅｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ａｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄａｔａｂａｓｅｗａｓｂｕｉｌｔｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｄａｔａｆｒｏｍｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ.ＴｈｅＸＯＤｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｄａｔａｂａｓｅｗｅｒｅｖｉｒｔｕａｌｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｗｉｔｈＡｕｔｏＤｏｃｋｓｏｆｔｗａｒｅ.Ｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｅｏｆｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅａｃ￣ｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｔｏＸＯＤｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｒｅａｒｅ１３ｃｏｍｐｏｕｎｄｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎＹｉｎｌｉａｎＧｏｕｔＧｒａｎｕｌｅｓｔｈａｔｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＸＯＤｗｉｔｈａｆｆｉｎｉｔｙｅｎｅｒｇｙｌｅｓｓｔｈａｎ－９.０ｋｃａｌ ｍｏｌ－１ꎬｍｏｓｔｏｆｗｈｉｃｈａｒｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ.ＢｉｎｄｉｎｇｍｏｄｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｏｆＸＯＤｉｎｃｌｕｄｅｄ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎꎬｈｙｄｒｏｐｈｏ￣ｂｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎｄｈｙｄｒｏｇｅｎｂｏｎｄｉｎｇｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＹｉｎｌｉａｎＧｏｕｔＧｒａｎｕｌｅｓｃｏｎｔａｉｎｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＸＯＤꎬａｎｄｍａｙｐｌａｙｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｇｏｕｔｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｕｒｉｃａｃｉｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＧｏｕｔꎻＵｒｉｃａｃｉｄꎻＸａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅꎻＶｉｒｔｕａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ㊀㊀痛风是一种以持续性高尿酸血症导致尿酸钠晶体在关节及其周围组织沉积为特征的嘌呤代谢性疾病[１]ꎮ痛风与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关ꎬ可诱发高血压㊁高血脂㊁动脉粥样硬化㊁肥胖㊁胰岛素抵抗等多种疾病ꎬ对人类的健康构成很大威胁[２]ꎮ黄嘌呤氧化酶(ＸＯＤ)能催化人体中尿酸的形成ꎬ是治疗高尿酸血症或痛风药物的关键靶点[３]ꎮＸＯＤ抑制剂作为抗痛风药物ꎬ目前临床上可用的只有别嘌呤醇和非布司他[３]ꎬ二者都具有一定的副作用并且发生率高ꎮ例如ꎬ在服用别嘌呤醇后ꎬ患者有皮肤过敏㊁肝炎㊁超敏反应综合征ꎬ甚至肝功能损害等副作用[４]ꎮ非布司他最常见的副作用为肝功能异常㊁恶心㊁皮疹和关节痛[５]ꎮ因此ꎬ研究新的高效低毒的ＸＯＤ抑制剂具有十分重要的理论意义和实际应用前景ꎮ茵连痛风颗粒为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院的自制复方制剂ꎬ由茵陈㊁连钱草㊁伸筋草组成ꎬ具有清热㊁利湿㊁通络的功效ꎬ用于治疗慢性痛风性关节炎ꎮ动物实验研究结果表明茵连痛风颗粒浸膏粉能够有效抑制尿酸生成ꎬ促进尿酸代谢ꎬ对痛风性关节炎具有良好的防治作用[６]ꎮ刘静等[７]通过大鼠痛风模型确定了茵连痛风颗粒中降尿酸的活性部位为黄酮㊁有机酸和生物碱类成分ꎬ但是具体的活性单体仍不是很清楚ꎮ本论文运用分子对接方法ꎬ以ＸＯＤ为靶点对茵连痛风颗粒中所含的化学成分进行了筛选ꎬ明确了其中对ＸＯＤ具有抑制作用的活性成分ꎬ并对部分代表性成分与ＸＯＤ的作用模式进行分析ꎬ为理解茵连痛风颗粒治疗痛风的作用机制及其作为抗痛风药物进一步开发奠定了基础ꎮ１㊀理论与计算方法从中药成分数据库(ｈｔｔｐ://ｌｓｐ.ｎｗｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｔｃｍｓｐ.ｐｈｐ)[８]下载茵连痛风颗粒３味中药所含１７５种化合物的结构文件ꎮ利用ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌ软件进行处理ꎬ把化合物结构由Ｍｏｌ２格式转成ＡｕｔｏＤｏｃｋＶｉｎａ[９]软件所需的ｐｄｂｑｔ格式ꎬ建立可供筛选的化合物数据库ꎮ从蛋白质数据库(ｗｗｗ.ｒｃｓｂ.ｏｒｇ)下载得到ＸＯＤ的晶体结构(编号:１Ｎ５Ｘ)ꎮ利用ＡＤＴ软件对晶体结构进行处理ꎬ去掉所含的结晶水ꎬ然后为ＸＯＤ结构添加极性氢原子和原子电荷ꎮ根据晶体中原配体的位置确定对接位点的中心坐标为(９６.６８Å㊁５５.７２Å㊁４０.７７Å)ꎬ３个维度的边长均为３０Åꎮ分子对接使用ＡｕｔｏＤｏｃｋＶｉｎａ软件完成ꎮ在对接过程中ꎬ只改变配体的构象ꎬ而保持ＸＯＤ的构象不变ꎮ选择与ＸＯＤ结合能最低的构象作为化合物最终的对接结果ꎮ抑制常数可根据公式Ｋｉ＝ｅｘｐ[әＧˑ１０００/(ＲｃａｌˑＴ)]换算得到ꎬ其中Ｔ＝２９８ＫꎬＲｃａｌ＝１.９８７１９ｃａｌ (ｍｏｌ Ｋ)－１ꎮ除特别声明外ꎬ其余所有参数均采用默认值ꎮ２㊀结果２.１㊀对接方法的检验㊀为了检验对接方法的可靠性ꎬ我们把晶体结构(编号:１Ｎ５Ｘ)中原有配体(非布司他)与空的ＸＯＤ晶体结构进行对接ꎬ比较对接的构象和原晶体结构中配体构象的差异ꎬ结果如图１所示ꎮ从图１中可以看出ꎬＡｕｔｏＤｏｃｋＶｉｎａ所预测的结合构象与原配体构象基本吻合ꎬ只在分子末端的异丙基构象稍有所差异ꎮ两个构象的均方根偏差(ＲＭＳＤ)只有０.９１Åꎬ说明我们所采用的对接方法能够准确预测分子的结合构象ꎮ２.２㊀分子对接结果㊀分子对接结果表明原配体(非布司他)与ＸＯＤ的结合能为－９.６ｋｃａｌ ｍｏｌ－１ꎮ以图１㊀分子对接方法所预测的配体结合构象(红色)与晶体结构(绿色)的比较非布司他为阳性参照物ꎬ我们仅列出了结合能在－９.０ｋｃａｌ ｍｏｌ－１以下的化合物的结合能及其抑制常数ꎬ如表１所示ꎮ从化合物的种类分布来看ꎬ我们所筛选出的化合物除了迷迭香酸为酚酸外ꎬ其余均为黄酮类㊁类黄酮类物质及其衍生物ꎮ动物实验研究结果表明痛风颗粒中降尿酸的活性部位为黄酮㊁有机酸和生物碱类成分[７]ꎮ这与我们的对接计算结果基本相符ꎮ从化合物的来源来看ꎬ其中１３个化合物中有９个来自连钱草ꎬ３个来自茵陈ꎬ而来自伸筋草中的只有１个ꎮ由此可见ꎬ在茵连痛风颗粒中对ＸＯＤ具有抑制作用的成分主要来自连钱草ꎮ表１㊀茵连痛风颗粒中单体成分与黄嘌呤氧化酶结合能әＧ及抑制常数Ｋｉ序号编号中文名әＧ/ｋｃａｌ ｍｏｌ－１Ｋｉ/μｍｏｌ Ｌ－１来源中药１ＭＯＬ０００００６木犀草素－１０.８０.１２连钱草２ＭＯＬ０００００８芹菜素－１０.４０.２４连钱草３ＭＯＬ００１６８９刺槐黄素－９.９０.５５连钱草４ＭＯＬ００００９８槲皮素－９.６０.９１连钱草５ＭＯＬ０００４２２山柰酚－９.６０.９１连钱草６ＭＯＬ０００００９木犀草苷－９.３１.５１连钱草７ＭＯＬ０１１８６５迷迭香酸－９.２１.７９连钱草８ＭＯＬ００１７９０蒙花苷－９.１２.１２连钱草９ＭＯＬ０００５０８木栓酮－９.０２.５１连钱草１０ＭＯＬ００５５７３芫花素－９.２１.７９茵陈１１ＭＯＬ００５１０９茵陈素－９.０２.５１茵陈１２ＭＯＬ００７２７４玄参黄酮－９.０２.５１茵陈１３ＭＯＬ０００３９２芒柄花黄素－９.２１.７９伸筋草２.３㊀活性化合物的结合模式分析㊀为了进一步明确这些活性成分与ＸＯＤ的具体结合模式ꎬ我们对非布司他和３个代表性化合物ꎬ即木犀草素㊁木犀草苷和迷迭香酸与ＸＯＤ的结合构象ꎬ进行了比较分析(见图２)ꎮ晶体结构表明非布司他中的羧基可以与ＸＯＤ中的ＡＲＧ８８０和ＴＨＲ１０１０形成氢键ꎬ同时非布司他中的噻唑环可以与ＸＯＤ中ＰＨＥ９１４和ＰＨＥ１００９形成－相互作用ꎮ非布司他中的苯基和末端的烷氧基则与ＸＯＤ中的ＬＥＵ０１４㊁ＶＡＬ１０１１㊁ＬＥＵ８７３㊁ＬＥＵ６４８和ＰＨＥ６４９等疏水性残基形成疏水相互作用ꎮ根据分子对接结果ꎬ我们发现木犀草素㊁木犀草苷㊁迷迭香酸与ＸＯＤ的结合模式与非布司他的十分相似ꎬ都是结合在活性位点的疏水区ꎮ３个化合物所含有的邻苯二羟基片段ꎬ其作用与非布司他中的噻唑环相当ꎮ邻苯二羟基结构中的苯环ＰＨＥ９１４和ＰＨＥ１００９形成－相互作用ꎬ其中的两个酚羟基则可以分别与ＡＲＧ８８０和ＴＨＲ１０１０形成氢键相互作用ꎮ木犀草素和木犀草苷中苯并吡喃片段作用和非布司他中的苯基相类似ꎬ可以与周围的疏水性残基形成疏水相互作用ꎮ除此之外ꎬ木犀草素中的羰基可以和ＸＯＤ中ＳＥＲ８７６形成氢键相互作用ꎬ而木犀草苷则通过其糖基中的羟基与ＳＥＲ８７６形成氢键ꎮ所以从相互作用的位点数来看ꎬ木犀草素与木犀草苷与ＸＯＤ结合能力基本相当ꎮ木犀草苷中亲水性糖基的存在ꎬ使其在与ＸＯＤ结合时需要较高的去溶剂化能ꎮ这可能是其活性比木犀草素弱的主要原因ꎮ迷迭香酸中不具有苯并吡喃这样的疏水片段ꎬ因此和黄酮类化合物相比疏水作用弱一些ꎬ但相应位置上的羧基可以与ＸＯＤ中的ＧＬＵ８０２和ＡＳＮ７６８形成氢键相互作用ꎮ同时ꎬ迷迭香酸末端的邻苯二羟基片段中的苯环可以与ＰＨＥ６４９形成ｐ－ｐ相互作用ꎬ其中的酚羟基还可与ＬＥＵ６４８形成氢键相互作用ꎮ因此ꎬ迷迭香酸对ＸＯＤ也具有一定的抑制能力ꎮＡ.非布司他ꎻＢ.木犀草素ꎻＣ.木犀草苷ꎻＤ.迷迭香酸图２　化合物与黄嘌呤氧化酶作用模式３　讨论茵连痛风颗粒在临床上对于痛风疾病的治疗具有很好的疗效ꎬ而且副作用小ꎬ适合长期服用ꎮ但是由于成分复杂ꎬ分离纯化难度大ꎬ对于其药效成分的研究只能停留在有效部位的层次上ꎬ而无法给出具体的活性单体[７]ꎮ基于分子对接的药物虚拟筛选方法是依据化合物与药物靶标的结合强度来预测药物活性ꎮ由于该方法不需要预先得到纯的单体成分ꎬ因此在中药活性成分的预测和筛选上具有广泛的应用[１０]ꎮ本论文利用虚拟筛选方法对茵连痛风颗粒所含的化合物进行了筛选ꎮ结果表明茵连痛风颗粒中有１３种化合物对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制作用ꎮ根据我们的预测ꎬ槲皮素对ＸＯＤ的抑制常数为０.９１μｍｏｌ Ｌ－１ꎮ这与Ｎａｇａｏ等[１１]的实验研究结果(０.２８μｍｏｌ Ｌ－１)基本一致ꎮ迷迭香酸和(下转第２７７页)ｏｍｅｄＲｅｐꎬ２０１４ꎬ２(３):４３７－４４１.[２１]ＧＯＮＧＧꎬＷＡＮＧＨꎬＫＯＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｒｅｉｄｅｎ￣ｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｏｆＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅＲａｄｉｘｔｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎ￣ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ－ｉｎｄｕｃｅｄａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄＲＡＷ２６４.７ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ２０１８ꎬ８(１):１７４１２.[２２]ＬＩＧꎬＸＵＹꎬＳＨＥＮＧＸꎬｅｔａｌ.ＮａｒｉｎｇｉｎＰｒｏｔｅｃｔｓＡｇａｉｎｓｔＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ－ＩｎｄｕｃｅｄＨｕｍａｎＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＩｎｊｕｒｙＶｉａＡｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎａｎｄＣＸ３ＣＬ１Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１７ꎬ４２(６):２５４０－２５５１.[２３]ＶＩＳＷＡＮＡＴＨＡＧＬꎬＳＨＹＬＡＪＡＨꎬＭＯＯＬＥＭＡＴＨＹ.ＴｈｅｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｒｏｌｅｏｆＮａｒｉｎｇｉｎ－ａｃｉｔｒｕｓｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄꎬａｇａｉｎｓｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｎｅｕｒｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓａｎｄｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｒｏｄｅｎｔｓ:Ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒꎬ２０１７(９４):９０９－９２９.[２４]ＤＯＮＧＷꎬＷＥＩＸꎬＺＨＡＮＧＦꎬｅｔａｌ.ＡｄｕａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｐｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｃｅｌｌ－ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｉｍｍｕｎｉｔｙｂｙＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ２０１４(４):７２３７－７２４９.(上接第２７１页)木犀草素对ＸＯＤ的抑制作用ꎬ也分别有实验研究报道[１２－１３]ꎮ对接结果表明黄酮类苷元(木犀草素)活性要强于其糖苷(木犀草苷)ꎬ这也与既有的实验结果相一致[１４]ꎮ所预测的１３个活性成分中有９个来自连钱草ꎬ说明连钱草在抑制ＸＯＤ的过程中发挥主要作用ꎮ从化合物结构来看ꎬ多数活性成分为黄酮类物质ꎮ进一步的作用模式分析表明ꎬ这些活性成分可分别通过ｐ－ｐ相互作用㊁疏水相互作用和氢键相互作用与ＸＯＤ相结合ꎮ我们的研究结果表明直接抑制黄嘌呤氧化酶从而降低尿素的生成是茵连痛风颗粒治疗痛风的可能机制之一ꎮ这为茵连痛风颗粒治疗痛风的临床应用和进一步开发提供一定的理论指导ꎮ参考文献:[１]㊀ＳＨＥＲＭＡＮＭＲꎬＳＡＩＦＥＲＭＧＰꎬＰＥＲＥＺ－ＲＵＩＺＦ.ＰＥＧ－ｕｒｉｃａｓｅｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｏｕｔａｎｄｈｙｐｅｒｕｒｉｃｅｍｉａ[Ｊ].ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖꎬ２００８ꎬ６０(１４):５９－６８.[２]ＨＡＹＤＥＮＭＲꎬＴＹＡＧＩＳＣ.Ｕｒｉｃａｃｉｄ:ａｎｅｗｌｏｏｋａｔａｎｏｌｄｒｉｓｋｍａｒｋｅｒｆｏｒｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎ￣ｄｒｏｍｅꎬａｎｄｔｙｐｅｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ:ｔｈｅｕｒａｔｅｒｅｄｏｘｓｈｕｔｔｌｅ[Ｊ].ＮｕｔＭｅｔａｂꎬ２００４ꎬ１(１):１０－１２.[３]展鹏ꎬ刘涛ꎬ刘新泳.以黄嘌呤氧化酶为靶点的新型非嘌呤类抗痛风及高尿酸血症药物研究进展[Ｊ].中国药物化学杂志ꎬ２０１２ꎬ２２(５):４０３－４１５.[４]ＰＡＣＨＥＲＰꎬＮＩＶＯＲＯＺＨＫＩＮＡꎬＳＺＡＢ Ｃ.Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ:ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅｈａｌｆａｃｅｎｔｕｒｙａｆｔｅｒｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ[Ｊ].ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｖꎬ２００６ꎬ５８(１):８７－１１４.[５]ＬＥＥＭＨꎬＧＲＡＨＡＭＧＧꎬＷＩＬＬＩＡＭＳＫＭꎬｅｔａｌ.Ａｂｅｎｅｆｉｔ－ｒｉｓｋａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｂｅｎｚｂｒｏｍａｒｏｎｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｇｏｕｔꎬＷａｓｉｔｓｗｉｔｈｄｒａｗａｌｆｒｏｍｔｈｅｍａｒｋｅｔｉｎｔｈｅｂｅａｓｔｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ[Ｊ].ＤｒｕｇＳａｆꎬ２００８ꎬ３１(８):６４３－６６５. [６]何耀ꎬ旷喜ꎬ彭海燕ꎬ等.痛风颗粒浸膏粉对高尿酸血症和痛风性关节炎的影响[Ｊ].华西药学杂志ꎬ２０１０ꎬ２５(３):２７２－２７４.[７]刘静ꎬ徐玲玲ꎬ徐熠.痛风颗粒抗痛风有效部位群研究[Ｊ].中草药ꎬ２０１３ꎬ４４(５):５９０－５９４.[８]ＲＵＪꎬＬＩＰꎬＷＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.ＴＣＭＳＰ:ａｄａｔａｂａｓｅｏｆｓｙｓｔｅｍｓｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｆｏｒｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓ[Ｊ].ＪＣｈｅｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２０１４(６):１３.[９]ＴＲＯＴＴＯꎬＯＬＳＯＮＡＪ.ＡｕｔｏＤｏｃｋＶｉｎａ:ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｐｅｅｄａｎｄａｃｃｕｒａｃｙｏｆｄｏｃｋｉｎｇｗｉｔｈａｎｅｗｓｃｏｒｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎꎬｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍｕｌｔｉｔｈｒｅａｄｉｎｇ[Ｊ].ＪＣｏｍｐｕｔＣｈｅｍꎬ２０１０ꎬ３１(２):４５５－４６１.[１０]朱伟ꎬ陈可冀ꎬ徐筱杰.计算机药物虚拟筛选技术在中医药领域中的应用前景[Ｊ].中国中西医结合杂志ꎬ２００７ꎬ２７(３):２６３－２６６.[１１]ＮＡＧＡＯＡꎬＳＥＫＩＭꎬＫＯＢＡＹＡＳＨＩＨ.ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＸａｎｔｈｉｎｅＯｘｉｄａｓｅｂｙＦｌａｖｏｎｏｉｄｓ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈＢｉｏｃｈꎬ１９９９ꎬ６３(１０):１７８７－１７９０.[１２]尚雁君ꎬ黄才国ꎬ蒋三好ꎬ等.迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用[Ｊ].第二军医大学学报ꎬ２００６ꎬ２７(２):１８９－１９１.[１３]ＹＡＮＪꎬＺＨＡＮＧＧꎬＨＵＹꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌｕｔｅｏｌｉｎｏｎｘａｎ￣ｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ:Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｍｅｒｇｉｎｇｗｉｔｈｄｏｃｋｉｎｇｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍꎬ２０１３ꎬ１４１(４):３７６６－３７７３.[１４]ＲＡＳＨＩＤＩＭＲꎬＮＡＺＥＭＩＹＥＨＨ.Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｆｌａ￣ｖｏｎｏｉｄｓｏｎｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＤｒｕｇＭｅｔａｂＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０１０ꎬ６(２):１３３－１５２.。

鼠曲草和芦荟黄嘌呤氧化酶抑制活性的研究黄真池;李恒【摘要】黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase XOD)是嘌呤代谢中的关键酶,催化嘌呤氧化生成尿酸.以别嘌呤醇为阳性对照,通过测定尿酸生成量,比较酸立通降酸茶、鼠曲草和芦荟的煎煮液和提取液对XOD活性的影响;并通过NBT显色法检测各样品清除超氧阴离子的能力.各样品对XOD都具有抑制作用,鼠曲草提取液抑制效果最好,抑制率达188.％,接近别嘌呤醇的水平(23.1％).各样品都具有清除超氧阴离子的能力,芦荟煎煮液清除率最高,达884.％.用AB-8大孔吸附树脂纯化各样品所得的黄酮类化合物对XOD抑制作用更强,清除超氧阴离子的能力更高.结论:鼠曲草和芦荟具有双重功效,既能抑制XOD的活性,又能高效地清除超氧阴离子.【期刊名称】《湛江师范学院学报》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】7页(P103-109)【关键词】鼠曲草;芦荟;黄嘌呤氧化酶;尿酸;超氧阴离子【作者】黄真池;李恒【作者单位】岭南师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048;岭南师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048【正文语种】中文【中图分类】Q946痛风是嘌呤代谢紊乱，导致尿酸在体内蓄积，引起高尿酸血症和尿酸盐结晶沉积所致的特征性急性关节炎，并引发尿酸盐肾病，尿路结石等，严重者可出现关节致残[1].另外，痛风还与高血压、肾脏疾病、高血脂症、糖尿病和心脑血管疾病等多种代谢紊乱综合征有关.黄嘌呤氧化酶( Xanthine Oxidase，XOD) 是嘌呤代谢中的关键酶，能催化嘌呤氧化生成尿酸，同时产生超氧阴离子自由基[2].抑制黄嘌呤氧化酶的活性可以从根本上减少尿酸生成，并减轻自由基造成的组织伤害[3].目前临床上治疗痛风的主要化学药物是别嘌呤醇，主要通过抑制XOD的活性控制尿酸生成，但使用别嘌呤醇常伴有发热、腹痛、白细胞及血小板减少，肝功能损害等严重副反应，影响其在临床中的使用[4,5].来源于中草药的天然产物可作为黄嘌呤氧化酶的抑制剂，低毒较安全，不易引起人体过敏反应且来源广泛[6,7].随着人们对中草药降尿酸作用的研究，多种中药材被证实具有一定的降尿酸功效.酸立通降酸茶是一种袋泡茶产品，主要中药成分为鼠曲草和西洋参，厂家声称其是天然产物来源的中药茶，有显著抑制尿酸合成、防治痛风的功效.鼠曲草(Gnaphalium affine D. Don)又名白艾、清明菜，菊科鼠曲草属植物，以野生为主，具有光防护、抑菌抗炎、保肝等作用，也可食用，是天然的药食资源.据报道，黄酮类成分为鼠曲草属植物中抗炎、抗氧化作用的主要活性成分[8].芦荟(Aloe vera)为百合科多年生常绿草本植物，原产于地中海、非洲，现在几乎遍及世界各地.芦荟是集食用、药用、美容、观赏于一身的植物新星，芦荟中主要含有槲皮素和芦丁等黄酮类物质[9].目前痛风症已被联合国列为21世纪20大顽症之一[10].从天然中草药中寻找安全无毒副作用的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有实际意义[11].本试验以别嘌呤醇为阳性对照，比较酸立通降酸茶、鼠曲草、芦荟对XOD的抑制作用.并用AB-8大孔树脂对样品进行分离纯化，分析其有效成分的活性，为降尿酸产品的研究开发及消费者的使用提供参考.1 材料和方法1.1 材料鼠曲草( Gnaphalium affine D. Don)，购于安徽诚信药家有限公司.芦荟(Aloe vera)，新鲜3年生美国芦荟肉质叶.酸立通鼠曲草袋泡茶(降酸茶),购于多尔顿药业公司.1.2 方法1.2.1 样品制备酸立通降酸茶：取一包袋泡茶(4 g)，用300 mL100 ℃开水冲泡10 min，室温下静置，冷却备用.鼠曲草煎煮液：取鼠曲草干草100 g，洗净后置于900 mL水中浸泡30分钟，加热煎煮浓缩至300 min，将煎煮所得液体真空抽滤，室温下静置，冷却备用.鼠曲草提取液：取鼠曲草干草100 g，洗净剪碎后研粉，加入95%乙醇300mL提取，置于电热恒温水浴锅浸泡2 d，温度60 ℃，真空抽滤，取上清液，回收滤渣进行2次提取，溶剂用量和提取时间都减半，合并2次的提取滤液，静置2 h.提取液用旋转蒸发器回收溶剂,剩余300 mL样品, 得到鼠曲草提取液.芦荟煎煮液：取新鲜完好的芦荟叶，洗净，沥干, 切薄片置于50 ℃烘箱内烘干至恒重，研粉置于保鲜袋中保存备用.称取100 g干粉洗净后置900 mL水中浸泡30 min，加热煎煮浓缩至300 mL，将煎煮所得液体真空抽滤，室温下静置，冷却备用.芦荟提取液：称取100 g芦荟干粉，同上制备鼠曲草提取液的方法.1.2.2 尿酸生成量测定采用分光光度法测定单位时间内在294 nm波长下尿酸的生成量，从而测定各样品酶活力的大小.体外对XOD的抑制实验方法参考 Umamahesari[13]等方法.反应体系为3mL，黄嘌呤底物浓度为0.6 mmol/L，黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2 U/mL，磷酸缓冲液pH7.5，别嘌呤醇液浓度为30 μg/mL，中草药样品液0.2 mL.每个样品均作3次生物学重复.1.2.3 NBT显色反应蓝色甲腙在560 nm处有最大吸收峰，用分光光度计测定其在560 nm处的吸光度，进一步判断各样品对XOD活性的影响.反应体系为3.5 mL，黄嘌呤底物溶液浓度为0.6 mmol/L，黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2 U/mL，磷酸缓冲液pH7.5，NBT浓度为0.6 mmol/L，30 μg/mL别嘌呤醇液，各中草药样品液0.2 mL.每个样品均作3次生物学重复.各样品对黄嘌呤氧化酶的抑制率的计算参考文献[15]的公式.1.2.4 超氧阴离子清除能力检测检测按参考文献[16]的方法.反应体系为3 mL，黄嘌呤底物溶液终浓度为0.6 mmol/L，黄嘌呤氧化酶的终浓度为0.2 U/mL，磷酸缓冲液pH 7.5，NBT浓度为0.6 mmol/L，30 μg/mL别嘌呤醇液，各中草药样品液0.2 mL.每个样品均作3次生物学重复.超氧阴离子清除率计算参考文献[17] 的公式.1.2.5 AB-8大孔吸附树脂纯化样品称取AB-8大孔吸附树脂100 g于95% 乙醇中浸泡2d，用大量蒸馏水洗至无醇，再用5% HCl溶液浸泡3 h，用蒸馏水洗至流出液pH 为中性，再用2% NaOH溶液浸泡3 h，蒸馏水洗，取处理过的树脂6.0 g，进行湿法装柱于层析柱(1.2cm×80 cm)，洗脱剂为60%乙醇溶液[18].每6 mL收集一管流出液，测定其在510 nm 处的OD值，以OD值为纵坐标，管数为横坐标绘制洗脱曲线.2 结果与分析图1 各样品对XOD的抑制率(尿酸生成量测定)2.1 酸立通降酸茶与鼠曲草煎煮液对黄嘌呤氧化酶的抑制比较别嘌呤醇、酸立通降酸茶、鼠曲草煎煮液对XOD 的抑制率分别为61.1%、39.4%、16.2%(图1).酸立通降酸茶比鼠曲草煎煮液对XOD 的抑制作用更为明显，二者差异达显著水平(P< 0.01).2.2 酸立通降酸茶与鼠曲草煎煮液的NBT显色反应通过测定超氧阴离子生成量可计算样品对XOD的抑制率.鼠曲草煎煮液对XOD活力的抑制率最显著，为78.7%，而酸立通降酸茶对XOD活力的抑制率仅为6.9%(图2)，显著低于鼠曲草煎煮液对XOD活力的抑制率(P<0.01).这一结果与尿酸生成量实验的结果(图1)相悖，据此推测鼠曲草煎煮液可能具有较强的超氧阴离子清除能力.图2 样品对XOD 的抑制率(NBT显色反应)2.3 酸立通降酸茶与鼠曲草煎煮液对超氧阴离子的清除能力测定图3 各样品对超氧阴离子清除活性对比图(a1，a2：鼠曲草；b1，b2：酸立通；c1，c2：对照)用NBT显色后，鼠曲草测定组的颜色明显浅于对照组(图3)，说明其对超氧阴离子具有较强的清除能力.计算结果，鼠曲草煎煮液超氧阴离子清除率达75.5%，而酸立通降酸茶对反应体系中超氧阴离子的清除率只有12.2%.进一步证明鼠曲草煎煮液对超氧阴离子具有较强的清除作用.2.4 鼠曲草与芦荟的煎煮液、提取液对XOD的抑制比较别嘌呤醇、鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液对XOD 的抑制率分别为54.3%、16.4%、47.5%、23.4%、27.6%(图4)，抑制率大到小依次为：鼠曲草提取液>芦荟提取液>芦荟煎煮液>鼠曲草煎煮液.鼠曲草、芦荟的提取液相比其煎煮液对XOD 的抑制作用更为明显.同一样品中，鼠曲草提取液和鼠曲草煎煮对XOD 抑制作用的差异达显著水平(P<0.01).图4 各样品对XOD 的抑制率(尿酸生成量测定)2.5 鼠曲草与芦荟的煎煮液、提取液NBT显色反应NBT显色反应结果如图5所示：别嘌呤醇、鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液对XOD 的抑制率分别为30.4%、79.2%、53.1%、88.4%、28.5%.鼠曲草、芦荟的煎煮液相比提取液对XOD 的抑制作用更明显.结合图3和图4结果，再次证明了鼠曲草煎煮液对超氧阴离子确实具有较强的清除作用；鼠曲草提取液对XOD的抑制率也达到了53.1%，说明其除了对黄嘌呤氧化酶有抑制作用之外, 还有直接清除自由基的作用.芦荟煎煮液对超氧阴离子也有较强的清除活性.图5 各样品对XOD 的抑制率(NBT显色反应)2.6 AB-8大孔吸附树脂对各样品的分离纯化图6 AB-8大孔树脂纯化样品的洗脱曲线a：鼠曲草煎煮液；b：鼠曲草提取液；c：芦荟煎煮液；d：芦荟提取液芦荟和鼠曲草富含黄酮且活性成分主要是黄酮类化合物.层析洗脱结果如图6所示：鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液洗脱曲线都有一个明显的主峰.说明AB-8大孔树脂对于鼠曲草、芦荟草黄酮的吸附率和解吸率都较高，其中鼠曲草提取液洗脱的峰形较为对称且尖，洗脱分离效果最好.2.7 鼠曲草、芦荟纯化组分黄嘌呤氧化酶抑制活性鼠曲草、芦荟纯化组分影响尿酸生成量结果如图7：别嘌呤醇、鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液对XOD 的抑制率分别为23.1%、3.0%、18.8%、5.2%、14.4%.以别嘌呤醇抑制率为对照，分离纯化后样品的抑制率大到小依次为：鼠曲草提取液>芦荟提取液>芦荟煎煮液>鼠曲草煎煮液，这与分离纯化前的各样品抑制率大小排序相同.分离纯化后的鼠曲草、芦荟提取液相比其煎煮液对XOD 的抑制作用更加明显；结合图6结果，证实芦荟和鼠曲草煎煮液、提取液中的黄酮类物质是XOD的主要抑制物.图7 各样品对XOD 的抑制率(尿酸生成量测定)3 讨论本研究以别嘌呤醇为阳性对照，通过尿酸生成法和NBT法比较了酸立通降酸茶、鼠曲草和芦荟对XOD的抑制效果.酸立通降酸茶、鼠曲草提取液和煎煮液、芦荟提取液和煎煮液都表现出较强的XOD抑制活性.但是尿酸生成法和NBT法检测结果差异明显.通过采用核黄素-甲硫氨酸光照法发现，鼠曲草和芦荟煎煮液清除超氧阴离子的能力较强，造成尿酸检测法和NBT法的结果相悖的原因在于鼠曲草和芦荟煎煮液能高效地清除超氧阴离子.经AB-8大孔树脂层析洗脱，鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液洗脱曲线在510 nm处都有一个明显的主峰，说明芦荟和鼠曲草对XOD的抑制主要来自黄酮类化合物.本研究改良核黄素-甲硫氨酸光照法检测鼠曲草和芦荟黄嘌呤氧化酶抑制活性，排除了黄嘌呤、样品液和酶液等对光吸收值的干扰，方法专属性强、重复性较好，可供筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂时应用.研究发现，鼠曲草和芦荟都具有双重功效，既能抑制XOD的的活性，又能高效地清除超氧阴离子，其中鼠曲草提取液抑制XOD效果最明显，接近别嘌呤醇的水平.鼠曲草和芦荟来源广泛、成本低廉、制备方法简单.以鼠曲草、芦荟为原料有望研发出既能降尿酸又能抗衰老的保健药物.【相关文献】[1] 展鹏，刘涛，刘新泳. 以黄嘌呤氧化酶为靶点的新型非嘌呤类抗痛风及高尿酸血症药物研究进展[J]. 中国药物化学杂志，2012，22(5):403-415.[2] 王春辉. 基于结构的黄嘌呤氧化酶抑制剂的设计、合成和筛选[D]. 沈阳:沈阳药科大学制药工程学院，2006:453-457.[3] 赵莹，张启虹，冯明声，等. 降尿酸药物黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展[J]. 药学进展，2009，33(2):55-61.[4] 焉翠蔚，赵庆娅，张珞，等. 海带提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用[J]. 中国海洋大学学报，2013，43(12):6-40.[5] 李英，陈君，李萍. 金银花中酚酸类和黄酮类成分的黄嘌呤氧化酶抑制活性[J]. 中国药科大学学报. 2011，42(5):407-411.[6] 张海德, 黄玉林, 何继芹. 丹参二萜醌对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志，2007，21(3):174-178.[7] 林伟青，谢建祥，王海东. 白艾提取液对高尿酸血症大鼠的实验研究[J]. 中华风湿病学杂志，2005，9(8):509-510.[8] 徐玉婷，吴丹慧. 鼠曲草的研究进展[J]. 医药导报，2012(2):122-123.[9] 柏玉平. 芦荟的药用价值与保健作用[J]. 绿化与生活，2004，(5) :14-15.[10] 黎莉. 中草药来源的黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展[J]. 中药材，2006，29(12):1386-1389.[11] 辛雅雯，曾正英，陈国良. 痛风治疗药物及其研究进展[J]. 中国药物化学杂志，2012，22(5):416-422.[12] 冯小晶. 嘌呤及其代谢产物尿酸检测方法研究和应用[D]. 山西：山西医科大学，2011：121-124.[13] Umamaheswar M. Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2007,109: 547-551.[14] 尚雁君，黄才国，蒋三好，等. 迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用[J]. 第二军医大学学报，2006，27(2):189-191.[15] 杨增明，杨树娟. 土连翘体外抑制黄嘌呤氧化酶活性研究[J]. 中药材，2010，33(6):964-967.[16] 白燕，秦碧殷，刘莺. 含硒含硫氨基酸清除超氧阴离子自由基的研究[J]. 营养学报，2009，31(1):26-29.[17] 韩少华. 丹参酚酸类化合物清除超氧阴离子活性评价研究[D]. 大连工业大学, 2009.[18] 朱中贵，蔡光明，王峰，等. 大孔树脂纯化艾叶总黄酮的研究[J]. 解放军药学学报，2009，25(1):10-13.。