第七章 植物花药和花粉培养

第一节 单倍体及单倍体育种
一、单倍体的概念及其来源
1、概念 单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数（n） 的孢子体(植物个体)。 单倍体有一元单倍体和多元单倍体。
南瓜的单倍体和二倍体 的雄花和雌花
单倍体植物的特点：
体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器
官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的
生根培养：将分化出的芽苗转入含NAA的生根培 养基中，一般2周左右可形成根。
烟草花粉植株的生根培养基： 1/2 MS + 2%蔗 糖 + 0.5%琼脂。
壮苗培养：在生根培养基或基本培养基中添加 多效唑（1-3mg/L），提高蔗糖浓度（5-8%）。
培养条件： 25 ℃，光照下。
花粉植株的驯化移植
② 激素选择
烟草和毛曼陀罗：仅含蔗糖的琼脂板 茄子花药培养中： MS＋2,4-D 0.5 mg/L＋KT 1mg/L
n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2 mg/L ＋ KT 1mg/L
n 64,1% 2n 35.9%
③ 蔗糖：一般为3％～15％
烟草和油菜：2～3％诱导花粉胚； 水稻：3～6％诱导愈伤，分化时2～3％； 小麦：8～11％麦芽糖诱导愈伤，分化时5～8％蔗 糖； 玉米：12～15％诱导愈伤； 甘蔗：高达20％。
➢ 二，认为小孢子发育过程中花药内源激素平衡在 不断改变，随花药的成熟，激素平衡变得不适合 小孢子的生长和分裂，或脱分化必须的一些物质 被消耗尽，从而引起培养效果不佳。
花粉发育时期的确定
•鉴定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 •为方便起见，可找出与花粉发育时期相对应的形 态学指标。
（3） 花药预处理
体细胞干扰 生殖细胞的自发加倍 培养过程的各种影响因素

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花药培养
（2）材料生理状态 花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导 率有直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株 比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都 明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有 显著变化，例如：水稻，早造比晚造接种的愈伤组织诱 导率要高；烟草，开花早期比开花晚期的花药可产生更 多的花粉植株；小麦，早期接种比晚期接种的材料愈伤 组织诱导率可提高2～3倍。说明供体植株的生态环境， 特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的 反应有重要影响。
第二节
花药和小孢子的发育
（以烟草花粉发育过程为例，说明被子植物花粉发 育过程，P222） 第一期：小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四 分体，随胼胝质分解，4个小孢子分离。 第二期：小孢子为球形细胞，核大，有液泡， 挤核靠边（单核靠边期），期末细胞明显增大，细 胞壁特化，小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂 （不对称），形成2个不均等的细胞。 第三期：小孢子细胞中有2个核。 在离体培养条件下，花粉发育偏离正常发育途 径，第一次花粉细胞有丝分裂是对称的，结果形成 两个形态和体积相等的细胞，把此作为B型。
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花药培养
2、材料预处理 对所取用的穗子或花蕾，进行低温、激素（生长 素）或其他方法预处理，能有效提高愈伤组织诱导 率和苗分化率。 （1）低温预处理： 一般是将材料置于冰箱5～10℃下冷藏一定时 间再接种。处理时间视不同植物而定，水稻在5～ 10℃时为5～8天，烟草在7～9℃时为7～14天。 同种植物不同品种的要求也有差异，需作试验比较 才能确定。
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花药培养
3、材料灭菌： 取回的材料，在接种前必须进行表面灭菌。一 般方法是先用70～75%酒精擦洗穗子和花蕾的外 部苞叶，然后用0.1%升汞浸泡7～10分钟（水稻、 玉米等需剥取穗子浸入消毒液）或用饱和漂白粉溶 液浸泡10～20分钟以灭菌，最后用无菌水冲洗3～ 5次，供接种用。 材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节， 此关不过，谈不上什么培养。

粉胚状体，最终分化为植株。 ② 液体培养: 悬浮培养，通气性差。 ③ 双层培养：上-液体+下-固体 ④ 看护培养：花粉-滤纸-固体培养基
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⑤ 条件培养基：在花药培养基中加入失活的花药提取物。
采用看护培养法： 无菌条件下，将花药接种在固体培 养基上→在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸 →用移液管吸 取l滴 每毫升含10个花粉粒的悬浮液接种在滤纸中央→形成 胚状体→分化为单倍体植株。
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2、花粉培养 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发 育为单倍体植株的技术。
特点: 它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织 的干扰，可以获得大量的花粉植株。
1）花粉的分离与纯化： 分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌） 纯化：用不同孔径的无菌筛子除杂。
2）花粉培养的方式： ① 平板培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花
培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进 行细胞学花粉发育时期的镜检。
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2 材料处理对花粉培养的影响
（1）低温度处理： Nitsch（1973）发现低温处理可以明显提高花 粉胚的诱导率，3℃下保存48h，然后花药接种，花粉胚的诱导率提高 了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药7～9℃下 7～14d为宜；水稻处理10℃、48h；小麦和黑麦需在1～3℃下2～20d 得到良好效果。
4、分化：愈伤组织1-2毫米时，转入分化培养基中， N6+2NAA（0.5mg/L）+KT(0.5mg/L)+蔗糖3%，温度 25℃，光照10h/d.
5、移栽：2周后，出根、芽。当花粉植株长到2-3个真叶时， 可转入1/2MS培养基中。低温医弱学pp光t 下练苗后可移栽于大田或18

梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致）
30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体）
(二)花粉培养方式
1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法： 先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。 4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉 小孢子发育。 5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养 6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提 取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。
双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效
例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化程度高。
左手持穗，右地手用用镊子于取遗出花传药，图无谱菌培的养皿构中建
1、影响花药诱导频率的因素
5、用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响
花药培养简史
1964年：印度学者古哈(Guha)和马斯瓦瑞 （Maheswari ） 将南洋金花花药培养发育成胚 1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植 株 1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植 株
〔优选〕花药培养和花粉培养
花的结构
处于不同发育时期的烟草小孢子
四分体: 醋酸洋红染色
四分体: Alexander’s 染 色
单核期
双核期
成熟花粉粒
一、概 述
花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养； 花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似 花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍 体植株。 单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样 可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种 重要手段。