注射用水内毒素检验方法验证方案
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注射用水细菌内毒素检验方法验证方案
1.0 目的
该方案确认制定的注射用水细菌内毒素检验方法适用于本公司微生物实验室对注射用水细菌内毒素的检验，方法能够提供一致、可信和准确的细菌内毒素检验结果。
2.0 范围
该方案适用于公司注射用水细菌内毒素检验方法的验证。
3.0 名词定义
BET：细菌内毒素测试(Bacterial Endotoxins Test)
EU：内毒素单位，1EU=1IU
λ：鲎试剂标示灵敏度
MVD：最大有效稀释倍数
4.0 描述
4.1 验证方法：中国药典<1143>细菌内毒素检查法；
4.2 验证用注射用水：取注射用水检测点的新鲜注射用水；
5.0 接受标准
注射用水细菌内毒素限度标准：＜0.25EU/ml
6.0 验证内容
6.1 验证前的准备：
6.1.1 验证器具准备
➢ 将内毒素反应试管及取样三角瓶放入铬酸洗液中充分浸泡，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用纯化水反复冲洗，晾干后放入不锈钢方盘或用锡箔纸包好后再放入不锈钢方盘内，置于干热灭菌烘箱。
➢ 将干热灭菌烘箱温度设定为250℃，灭菌时间设定为1h，开启灭菌程序，灭菌程序结束待灭菌烘箱温度降至室温。
6.1.2 主要仪器设备/试剂、对照品：
设备：细菌内毒素检测仪、干热灭菌烘箱、医药冷藏箱
试剂、对照品：细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂
细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中阳性及供试品阳性溶液的制备、鲎试剂灵敏度复核试验。
细菌内毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。
6.2 验证过程：
6.2.1 鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。实验室在使用一批新的鲎试剂进行细
菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。
6.2.1.1 内毒素标准溶液的制备：取内毒素工作标准品一支，加入1ml内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。用检查用水将其稀释制成4个浓度的内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ(λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30s。
6.2.1.2 鲎试剂的准备：取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
6.2.1.3 加样：将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，其中16管分别加入0.1ml 2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行4管。另2管加入0.1ml检查用水作为阴性对照。加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温(60±2)min。
6.2.1.4 结果观察：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)，将试验结果记录于“TP00003-A02鲎试剂灵敏度复核记录”，并将记录复印。
6.2.1.5 结果计算：当最大浓度(2λ)4管均为阳性，最低浓度(0.25λ)4管均为阴性，阴性对照为阴性时，试验为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。
)4(lg1Xc
式中X为反应终点浓度的对数值(lg)，反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
6.2.2 验证试验
6.2.2.1 内毒素标准溶液制备：
➢ 取1支细菌内毒素工作标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成5个浓度的标准溶液即4λ、2λ、1λ、0.5λ、0.25λ(方法同鲎试剂灵敏度复核6.2.1.1项下内毒素标准溶液制备)。
6.2.2.2 供试品溶液制备：
➢ 取0.5ml注射用水样品，加入0.5ml细菌内毒素检查用水，即得1:2稀释比例的供试品溶液。
6.2.2.3 供试品阳性溶液制备：
➢ 取0.5ml上述稀释后的供试品溶液，分别加入0.5ml上述4λ、2λ、1λ、0.5λ内毒素标准溶液，即得2λ、1λ、0.5λ、0.25λ含内毒素的供试品阳性溶液。
6.2.2.4 鲎试剂的准备：
➢ 取规格为0.1ml/支的鲎试剂28支，轻弹前壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml细菌内毒素检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解。
6.2.2.5 加样
➢ 按照下表进行干扰试验溶液的制备及加样。
编号 内毒素溶液/被加入内毒素的溶液 稀释
用液 稀释
倍数 所含内毒素
的浓度 平行管数
A 无/供试品溶液 － － － 2
B 2λ/供试品溶液 供试品
溶液 1
2λ 4
2 1λ 4
4 0.5λ 4
8 0.25λ 4
C 2λ/检查用水 检查
用水 1
2λ
2
2 1λ 2
4 0.5λ 2
8 0.25λ 2
D 无/检查用水 － － － 2
➢ 将准备好的鲎试剂取10支放在试管架上，其中8支分别加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行2管。另2管加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
➢ 将另外18支鲎试剂放在试管架上，其中16管分别加入0.1ml的含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素供试品阳性溶液，另2管加入0.1ml供试品溶液作为供试品阴性对照。
➢ 加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温(60±2)min后，观察并记录结果。
6.2.2.6 试验结果计算
➢ 如B、C两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，A、D两组4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的阳性对照溶液(即C组)反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液制成的供试品阳性溶液(即B组)的反应终点浓度的几何平均值(Et)。
)4(lg)4(lg11ttssXEXE
式中Xs、Xt分别为检查用水和供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。
6.2.2.7 结果判断
当Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时，且Et在0.5Es～2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时，则认为供试品在该条件下无干扰作用，可在该条件下对注射用水进行细菌内毒素检查。当Et不在0.5Es～2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时，则认为注射用水在1:2稀释倍数下有干扰作用，应使用适宜方法排除干扰，如对注射用水进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰，再重复干扰试验。
7.0 偏差
如果某个测试结果与合格标准不相符，则必须进行彻底调查并找出根本原因，在附件《偏差报
告表》中描述纠正措施及解决方法，如有必要，需按有关规定进行重新验证。
8.0 附表
8.1 验证设备及试剂、对照品确认
8.2 注射用水细菌内毒素验证结果
8.3 偏差报告表
.
附件1：验证设备及试剂、对照品确认
审核所用测试设备的校验/确认状态，并在下表记录校验/确认有效期。所有设备/仪表在验证期间的校验/确认必须在校验/确认有效期内。如果在验证期间所用设备的校验/确认有潜在的超出校验/确认有效期的风险，则在验证前对设备/仪表重新校验/确认。
表1
设备名称 设备编号 校验日期 校验有效期
细菌内毒素检测仪
干热灭菌烘箱
可接受标准 确认使用的仪器设备经过确认和校验并在有效期内
结论
表2
试剂、对照品名称 批号
规格/灵敏度 生产商
有效期
细菌内毒素工作标准品
细菌内毒素检查用水
鲎试剂
鲎试剂
可接受标准 确认使用的培养基适用性结果合格并在有效期内
结论
备注:
确认人/日期: _________________________ 复核人/日期: ________________________
附件2：注射用水细菌内毒素验证结果
第一次验证日期： 样品批号：
1. 仪器、试剂
烘箱编号/校准有效期：
细菌内毒素检验仪编号/校准有效期：
细菌内毒素检查用水批号： ；规格： ；生产厂家：
细菌内毒素工作标准品批号： ；规格： ；生产厂家：
鲎试剂批号： ；灵敏度(λ)： ；生产厂家：
2. 实验过程
2.1 A组/供试品溶液制备：
2.2 B组/供试品阳性溶液制备：
2.3 细菌内毒素标准溶液制备(EU/ml)：
2.4 试验条件： ，鲎试剂厂家：湛江安度斯生物有限公司
2.5 试验结果记录：
编号 内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 稀释用液 稀释
倍数 内毒素浓度 结果
A 无/供试品溶液 / / /
B 2λ/供试品溶液 供试品溶液 1 2λ 2 λ
4 0.5λ 8 0.25λ
C 2λ/BET水 BET水 1 2λ 2 λ 4 0.5λ
8 0.25λ D 无/BET水 / / /
计算结果 Es=antilg(∑Xs/4)=
Et=antilg(∑Xt/4)=
可接受标准 溶液A和D组的测试结果均为阴性；溶液C组反应终点浓度的几何平均值(Es)在0.5λ~2λ之间(包括0.5λ和2λ），溶液；溶液B组反应终点浓度的几何平均值(Et)在0.5Es~2Es之间（包括0.5Es和2Es）
结论
检验人/日期: 复核人/日期:
