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高三尖杉碱酯

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高三尖杉碱酯摘要：高三尖杉醋碱(Homoharringtonine, HHT)是从我国特有三尖杉属植物海南粗框中分离得到的有效抗癌药物，我国从七十年代起率先将其用于急性髓系白血病(AML)和慢性髓系白血病(CML)的临床治疗，疗效显著。

研究表明HHT 对AML 和CML 细胞作用时，可以激活caspase 家族中caspase3, caspase8, caspase9等，诱导白血病细胞凋亡。

关键词：生物碱，白血病，提取一． 高三尖杉碱酯的物理性质高三尖杉碱酯（Homobarringtonie 缩写HHT ）又名：高粗榧碱，后哈莫林通碱，高俣林通碱 分子式：93929NO H C 为类白色或微黄色结晶性粉末或无定形疏松固体；有引湿性；遇光色变深。

在甲醇、乙醇或氯仿中易溶，在水或乙醚中微溶。

熔点本品的熔点为143～147℃。

二、高三尖杉碱酯高三尖杉酯碱可以用以下方法获得： 将三尖杉属植物的茎、叶、根、果皮经细胞悬浮培养或组织培养和次级培养； 也可以从含有HHT 的植物材料或培养细胞或植物组织经溶媒提取、分离、精制得到；还可以从提取过的三尖杉属植物的残渣中经半合成方法获得。

此外，HHT 还可以与其他植物成分如：贯众素、麦冬素、苦参碱和靛玉红合并使用,能使癌细胞转化为正常细胞,诱导癌细胞凋亡,抑制癌细胞生长。

（一）中国粗榧的枝叶中高三尖杉酯碱的分离和提取1． 试验材料: 中国粗榧的干燥枝叶、粉碎。

试剂:乙醇、氯仿、乙醚均为化学纯, 柠檬酸、磷酸氢二钠。

标准品购于中国药品生物制品检定所。

2．实验方法（1） 回流提取: 将粉碎枝叶用90%乙醇浸没, 加热回流提取3次, 提取液合并置浓缩器中, 减压浓缩回收乙醇至流浸膏。

（2） 梯度萃取: 将流浸膏用5%醋酸溶解，浓氨水调节pH 值。

用氯仿在pH= 3，6，9 时梯度萃取。

pH = 3，9的萃取物为杂质，另浓缩; pH=6的氯仿萃取液减压浓缩至膏, 为所要总生物碱。

（3） 逆流分布法: 用柠檬酸和磷酸氢二钠配制pH=4左右的缓冲液为固定相，流动相为氯仿二相互相饱和。

用流动相把pH= 6 获得的样品溶解, 放在分离器中进行逆流分布。

用薄层跟踪检查各分离器的上、下层溶液,至获得高三尖杉酯碱的单一成分的粗制品时分别收集、待精制。

（4）精制——吸附柱层析法: 用32O Al 作吸附剂，将高三尖杉酯碱抽松后的粗品用适量二氯甲烷溶解上柱,用乙醚洗脱,等量收集流出液,流出液用薄层检查,所得高三尖杉酯碱即为纯品。

( 5) 薄层层析检测: 硅胶G 加1%NaOH, 湿法制板, 晾干过夜。

展开剂: 乙醚-丙酮( 2∶1) 。

显色剂:改良碘化铋钾试液, 呈红色棕色。

经质谱和红外光谱鉴定, 所分离样品与标准品一致。

（二） 中国粗榧的果实高三尖杉酯碱的分离和提取1． 生药处理: 将果实脱去果肉、果壳, 取果仁榨去油, 残渣用石油醚脱去残存油脂, 挥发去溶剂, 得果仁脱脂粉末。

2． 提取总生物碱: 用95% 乙醇冷浸果仁粉末,渗滤至渗漉液无生物碱沉淀反应, 渗漉液减压浓缩回收乙醇至流浸膏。

3．梯度萃取: 同（一）•24 逆流分布法分离三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱: 同（一）•35 精制—— 吸附柱层析法:同（一）•46 薄层层析检测: 同（一）•5三、高三尖杉碱酯药用原理新近展1. HHT 抑制急性髓系白血病细胞株细胞的生长通过实验首先采用不同浓度HHT (0-80ng/ml 于K562和HL60细胞，0-40ng/ml 于U937细胞)分别作用3种AML 细胞株细胞K562, HL60和U937细胞24h,48h 和72h ，采用MTT 法检测HHT 对细胞生长的影响。

结果显示:HHT 能显著抑制这3种细胞株的生长。

随着HHT 浓度的升高，各细胞株细胞存活率逐步降低(见表1, 2, 3和图1, 2, 3)，对这种药物剂量与生长抑制作用做直线相关分析，并对相关系数r 值做假设检验。

3种细胞在各自时间点的生长抑制率都与HHT 剂量呈正相关，说明HHT 对AML 细胞株细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性。

此外，HHT 对3种细胞株的生长抑制作用也呈时间依赖性.同一浓度下，药物作用时间越长，细胞存活率也越低。

同一细胞株中，药物作用时间越长，IC50也越低。

HHT 对K562, HL60和U937细胞在24h 的IC50依次是:44.53ng/ml, 29.32ng/ml, 7.69ng/ml;处理48h 后，各细胞株的IC50分别是:23.92ng/ml, 19.91ng/ml, 5.50ng/ml;而处理72h后，各细胞株的IC50分别是: 17.75ng/ml, 15.71ng/ml、5.37ng/mlo表1 HHT对k562细胞生长的影响(MTT法)(N=3)Conc Cell Viability(of%control)Time 0ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 40ng/ml 80ng/ml24h 0 81.16士2.16 63.02士2.67 50.15士2.50 40.14士2.16 48h 0 74.10士4.84 49.06士2.15 33.73士1.27 27.06士1.30 72h 0 67.78士2.04 39.99士1.50 30.52士2.24 21.70士2.45表2 HHT对HL60细胞生长的影响(MTT法)(N=3)Conc Cell Viability(of%control)0ng/ml l0ng/ml 20ng/ml 40ng/ml 80ng/ml24h 0 81.16士2.16 63.02士2.67 50.15士2.50 40.14士2.16 48h 0 74.10士4.84 49.06士2.15 33.73士1.27 27.06士1.30 72h 0 67.78士2.04 39.99士1.50 30.52士2.24 21.70士2.45表3 HHT对U937细胞生长的影响(MTT法)(N=3)Conc Cell Viability(of%control)Time 0ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 40ng/ml 80ng/ml24h 0 81.16士2.16 63.02士2.67 50.15士2.50 40.14士2.16 48h 0 74.10士4.84 49.06士2.15 33.73士1.27 27.06士1.30 72h 0 67.78士2.04 39.99士1.50 30.52士2.24 21.70士2.45表2.4 HHT浓度与不同细胞株作用24-72h后生长抑制率之间的相关系数细胞株 24h 48h 72hr p r p r pK562 0.900 0.000 0.858 0.000 0.832 0.000 HL60 0.859 0.000 0.899 0.000 0.886 0.000U937 0.822 0.000 0.813 0.000 0.815 0.000R 为相关系数表5细胞株作用时间24h 48h 72h K562 44.53 23.93 17.65 HL60 29.32 19.91 15.71 U937 7.69 5.50 5.37图1 HTT作用于K562细胞的生长变化曲线（n=3）图2 HTT作用于HL60细胞的生长变化曲线（n=3）图3 HTT作用于U937细胞的生长变化曲线（n=3）2 HHT对K562细胞周期影响细胞周期阻滞是化疗药物诱导细胞凋亡的重要机制之一，通过实验检测了HHT对K562细胞周期的影响。

结果发现 HHT对K562无明显的周期抑制，说明HHT诱导AML细胞凋亡并不通过细胞周期阻滞通路。

作用时间达到24h后，凋亡细胞明显增加，24h和48h的凋亡细胞比例分别为13.95士1.32%和14.31士1.21%。

与对照组相比，24h和48h的凋亡细胞比例均明显增加，统计学有非常显著差异(P<0.01 ), 24h和48h P值均为0.003.3 HHT诱导AML细胞凋亡25-100ng/m1HHT作用K562细胞24 h, Annexin V及PI双标记细胞后流式细胞仪检测结果显示，Annexin V阳性，PI阴性细胞(早期凋亡)百分比分别为:5.22土0.58%, 11.38士0.72%, 15.22士1.64%，空白对照为1.11士0.34。

对药物剂量与早期凋亡细胞比例做直线相关分析，并对相关系数r值做假设检验。

统计学分析结果表明，K562细胞早期凋亡细胞比例与HHT剂量呈正相关，t=0.960,P=0.000。

说明HHT诱导K562细胞早期凋亡呈剂量依赖性。

25}100n留ml HHT作用U937细胞24h, Annexin V阳性，PI阴性细胞百分比分别为:11.44士0.91%, 22.57土2.17%, 36.71士2.98%，空白对照为0.65士0.32%。

对药剂量与早期凋亡细胞比例做直线相关分析，并对相关系数:值做假设检验。

统计学分析结果表明，U937细胞早期凋亡细胞比例与HHT剂量呈正相关，r=0.986, P=0.000。

说明HHT诱导U937细胞早期凋亡呈剂量依赖性。

4 HHT对K562细胞miRNA表达的影响采用50ng/m1HHT分别处理K562细胞3、12和24h，进行miRNA芯片分析。

芯片实验由上海康成公司完成，采用板内4复孔重复，采用丹麦Exiqon公司芯片。

试验中经SPSS软件分析，与未处理对照组相比，我们发现有13种miRNA(miR-17 ,miR-17*、miR-18a, miR-18b, miR-20a, miR-20b, miR-93、miR-106a, miR-126,miR-142-Sp, miR-144, miR-233和miR-320)在HHT作用K562细胞3h, 12h和24h 后3个时问点均表达下调(与对照组相比差异大于 1.5倍)。

现3个时间点均表达上调的miRNA.对13种miRNA进行类别分析，发现属于miR-17-92基因簇的有miR-17,miR-17*, miR-18a和miR-20a 4种，miR-17又称miR-17-Sp, miR-17*又称miR-17-3p, miR-17-92基因簇编码miR-17, miR-17*, miR-18a, miR-19a, miR-20a,miR-19b-1和miR-92-1等7个miRNAs，在多种肿瘤中高表达，能作为致癌基因诱发淋巴瘤和血管肿瘤的发生[X82"g4} omiR-17-92基因簇其中的一半以上在HHT处理K562细胞中下调，表明miR-17-92基因簇在HHT诱导K562细胞凋亡中占有重要作用。

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高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合G-CSF 治疗老年急性髓细胞白血病临床研究

高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合G-CSF 治疗老年急性髓细胞白血病临床研究

高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合G-CSF 治疗老年急性髓细胞白血病临床研究摘要】目的：研究分析高三尖杉酯碱、阿糖胞苷与G-CSF联合治疗老年急性髓细胞白血病的临床效果。

方法：选择2010.02-2013.02 期间在我院接受治疗78例急性髓细胞白血病患者，运用计算机将其平均分成2组，一组39例患者应用柔红霉素与阿糖胞苷联合治疗设为对照组；一组39例患者应用高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合G-CSF治疗设为研究组。

结果：研究组患者的总有效率约为87.18%（34/39）明显大于对照组的69.23%（27/39），差异P<0.05有统计学意义。

并且研究组患者临床并发症的发生率、3年内复发率均显著小于对照组，差异P<0.05有统计学意义。

结论：高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合G-CSF治疗老年急性髓细胞白血病取得了显著成效，并且产生的毒副反应较少，远期复发率较低，更适用于临床治疗的推广、应用。

【关键词】高三尖杉脂碱；阿糖胞苷；G-CSF；老年急性髓细胞白血病；疗效【中图分类号】R2 【文献标号】A 【文章编号】1671-8725（2014）10-0034-02 急性髓细胞白血病（英简AML）是发病于外周血、骨髓或其他组织内的一种髓细胞克隆性增殖性疾病[1]。

临床中对血液恶性疾病，特别是白血病等肿瘤疾病的治疗，一般采取化疗治疗，但是老年AML患者由于脏器功能衰弱，免疫抵抗能力较弱，在化疗治疗中很容易出现感染，或是重要脏器、出血等临床并发症，对化疗的耐受性较差，给临床治疗造成了较大风险。

现选择2010.02-2013.02期间在我院接受治疗78例急性髓细胞白血病患者，进一步探析新化疗药物、不同机制药物联合化疗治疗的效果及安全性，具体如下。

1 资料与方法1.1 一般资料选择2010.02-2013.02 期间在我院接受治疗78例急性髓细胞白血病患者，运用计算机将其平均分成2 组，每组各有39例患者。

研究组中，包括18例男性患者，21例女性患者。

联合使用高三尖杉酯碱与放血治疗真性红细胞增多症的疗效分析

联合使用高三尖杉酯碱与放血治疗真性红细胞增多症的疗效分析

症： ①白细胞＞ １ ２ ×１ ０ ／ Ｌ，②血氧饱 和度＞ ９ ２ ％；③ 中性粒 细胞碱性磷
化Ⅲ 。我院自２ ０ ０ ９ 年１ ２ ． ， ９ 至２ ０ １ １ 年９ 月期间对收治的真性红细胞增多症 患者采用高三尖杉酯碱联合放血进行治疗２ ６ 虱睚冒雷—圈瞳噩 ２ ０ １ ３年 １ 月第 １ １ 卷 第３ 期
表２ 两组 患者 的 临床 疗 效对 比 （ ｈ ）
・
临床研 究 ・ ２ ０ ９
样 ，但多 以部分脑 神经支配 的肌 肉无力 ，屈 颈肌及呼吸肌 为主 ，呼吸 肌麻痹 是其最 为严 重的表现 ，也是致死 的主要 原因。 在 本组实验 中 ，研究 组患者给予早 期足量 长托 宁治疗 ，经过治疗 后 ，研究 组患 者的 血胆 碱酯 酶的恢 复 时间 、症 状 消失 时间 、住 院时
±９ ． ２ ８ ）ｍ ｇ ；平均 给 药 时间 为 （ ３ １ ． ２ ２ ±１ ５ ． ２ ３ ）ｄ ；平 均放 血 量 为 （ １ ４ ５ １ ． ０ ２ ±４ １ ２ ． ６ １ ）ｍＬ 。结 论 联合 使 用 高三 尖 杉酯碱 与放 血 治疗真 性 红
细胞 增 多症 具 有疗程 短 、 见效快 以及副作 用小等 诸 多优点 ，值 得 临床 推 广应 用 。 【 关键 词 】 高三 尖杉 酯碱 ；放 血 治疗 ；真 性 红细胞 增 多症 ； 临床 疗 效
参考文献
表４ 两组 患者 的 不 良反应 发生率 对 比 （ ｎ ／ ％）
［ １ 】 孙虹 ， 朱 莎． 长 托宁 联合 氯磷 定 突击疗 法 治疗 急性 有机 磷 中毒 中 间综合 征疗 效观 察［ Ｊ ］ ． 临 床急 诊杂 志， ２ ０ ０ ８ ， ９ （ ６ ） ： ３ ５ ６ ． ３ ５ ８ ．
高三尖杉酯碱联合全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的疗效观察

高三尖杉酯碱联合全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的疗效观察

高三尖杉酯碱联合全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的疗效观察仲小敏;徐开林【摘要】目的：探讨高三尖杉酯碱联合全反式维甲酸治疗老年急性早幼粒细胞白血病的临床疗效。

方法70例老年急性早幼粒细胞白血病患者按照随机数字表法分组为对照组与观察组，各35例。

对照组采用全反式维甲酸治疗，10 mg／次，口服；观察组根据临床症状先采用全反式维甲酸口服治疗，再于此基础上加用高三尖杉酯碱静脉注射治疗。

比较2组临床疗效、生存质量、毒副作用。

结果治疗组治疗有效率为45．71％（16／35），与对照组40．00％（14／35）比较，P＞0．05；治疗组治疗获益率为57．14％（20／35），明显高于对照组45．71％（16／35）（P＜0．05）；2组患者KPS改善率比较，P＜0．05。

治疗组治疗期间不良反应率为48．57％（17／35），明显低于对照组77．14％（27／35）（P＜0．05）。

结论虽然单纯采用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的临床疗效与高三尖杉酯碱联合全反式维甲酸的治疗效果相当，但后者临床总体疗效较好且能显著改善患者生存质量，降低不良反应，值得推广应用。

%Objective To study the clinical efficacy of homoharringtonine combined with all-trans retinoic acid ( ATRA) for acute promyelocytic leukemia in elderly patients .Methods 70 cases of acute promyelocytic leukemia in elderly patients ac-cording to the random number table were divided into the control group and the observation group ,35 cases each.The control group received ATRA treatment ,10 mg/time,orally;the observation group first received ATRA treatment based on clinical symp-toms,then received homoharringtonine intravenous therapy .Cinical efficacy,quality of life,andside effects of the 2 groups were compared.Results The effective rate of the treatment group was 45.71%(16/35),and that of the control group was 40.00%(14/35)(P>0.05);therapeutic gain of the treatment group was57.14%(20/35),which was significantly higher than that of the control group,45.71%(16/35)(P<0.05);KPS improvement rates between the 2 groups had significant difference (P<0.05).Adverse reactions of the treatment group was 48.57%(17/35),which was significantly lower than that of the control group,77.14%(27/35)(P<0.05).Conclusion ATRA and homoharringtonine combined with ATRA for acute promyelocytic leukemia have similar clinical efficacy .The overall clinical efficacy of the latter is better ,and it improves the quality of life of pa-tients significantly and reduces side effects ,it should be widely applied .【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】3页(P1679-1681)【关键词】全反式维甲酸;急性早幼粒细胞白血病;高三尖杉酯碱【作者】仲小敏;徐开林【作者单位】223300 江苏省南京医科大学附属淮安第一医院;221002 江苏省徐州医学院附属医院【正文语种】中文【中图分类】R733.7急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一种异常的早幼粒细胞占主导的特殊类型急性髓系白血病。

高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱含量

高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱含量

试 验 与 检 测
高效液相色谱法测定高三尖杉酯碱含量
赵 青
３ １ ２ ０ ｏ ｏ 绍 兴铜都矿业集 团有 限公 司
摘要： 目的： 建 立高效液相色 谱方法测定高 三尖杉 酯碱 （ ｈ ｏ ｍ ｏ ｈ ａ ｒ ｒ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｎ ｉ ｎ ｅ ， Ｈ Ｈ Ｔ ） 含 量。方法 ：采用 Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ— Ｃ １ ８ （ ４ ． ６ ×１ ５ ０ ｍ ｍ ５ ｐ ． ｍ） 色谱柱 。以 乙腈一Ｏ ． ２ ％ 醋酸溶液 （ 用０ ． ５ ％ 三 乙胺溶液调 节 ｐ Ｈ 至６ ． ５ － Ｉ － Ｏ ． ２ ） （ ２ ４ ：７ ６ ） 为流 动相 ，流速 １ ． ０ ｍ ］ ， ｍ １ ｎ ，柱温 ２ ５ ｃ ｃ ，检测波长 ２ ８ ８ ｎ ｍ 。结果 ：当高三 尖杉酯碱 的浓度在 ８ Ｏ ． ８ ４ Ｎ ． ｇ ｌ ｍ ｌ 至１ ２ ０ ． ４ ８ ｐ ｇ／ ｍ ｌ 即为常规检测量的 ８ ０ ％ １ ２ ０ ％ 内时，其峰面积与浓度 的线性关系 良 好， ＝ Ｏ ． ９ ９ ９ ８ 。平均回收率为 １ Ｏ ０ ． ４ ６ ％ ，Ｒ Ｓ Ｄ ＝ Ｏ ． １ ８ ％ 。结论 ：本方法测定结果准确 ，操作简便 ，分析快速。适用于 Ｈ Ｈ Ｔ 原料 药的含量测定。
１ 、仪 器与试药
Ａｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ ． １ １ ０ ０色谱仪及工作站 ； ＡＧ１ ３ ５电 子分 析天平 ；高三尖杉酯碱 工作标准 品 （ 批 号：０ ４ ０ ６ ０ １含量：１ ｏ ０ ％） ；三尖杉碱工作标 准品 （ 批号：０ ４ ０ ７ ０ １含量 ：ｌ ０ ０ ％） ；检验用 样品 （ 由公 司连续生产 的三批原料 药样品 ， 批 号 ：０ ５ ０ ４ ０ １ 、０ ５ ０ ４ ０ ２ 、０ ５ ０ ４ ０ ３ ） ： 纯化 பைடு நூலகம் ； 三乙胺 （ 分析纯） ；冰 醋酸 （ 分析纯 ） 。