SCGE简要操作流程及注意事项

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1.铺胶(第一层)
载玻片从酒精中拿出后用干净的纱布擦干,注意不要沾上纤维和灰尘。
将载玻片,玻璃棒预热,85μl正常溶点1%琼脂糖铺第一层。保持温度,快速。
铺好后室温晾干,转移至4℃保存。
第1层是紧贴玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶,4℃存放约20分钟,如时间过
短,不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落;
反之,时间过长,凝胶极易干裂而脱落。
2.接种细胞
细胞浓度 5x105cells/ mL × 2 mL×6wells, 加药200uL,孵育30min。
预冷的PBS洗两遍,加AAPH uL,立即放入4℃,30min。
3. 收集样品
离心收集, 2500rpm x 10min收集,然后加原体积PBS重悬。
4. 铺胶(第二层)
制胶前先冻好冰,保证冰面水平。
配制凝胶细胞悬液:细胞液与LMA的比例为1:7.5(10μL细胞悬液和75μL 0.6%的低熔点
琼脂糖(LMA) 37℃混匀)。制备的细胞悬液45-80μL铺展到载玻片上作为第二层, 盖盖玻片,
立即放在冰袋上,使载玻片骤冷至凝固。
与细胞混合时琼脂糖液的温度30~37℃,温度过高可引起细胞损伤,此操作过程力求
快速,以免加速细胞DNA 的修复。

5. 裂解
4℃凝固后去掉盖玻片,将载玻片浸入新配制的4℃预冷细胞裂解液中,放入4℃冰箱内
裂解2h。裂解液最好当天配,一定要4℃预冷;从这一步开始,动作要尽量轻缓,以防脱胶;
一定要避光。

6. 电泳
裂解后将玻片置于电泳槽中,缓冲液盖过胶面,静置20min解链。之后接通电源,25V,
300mA,20-40min。通过调节液面来调电压。 (电压先调到最大,电流300mA,然后通过液
面高低来调节电压)。电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行),电泳时
间多在20~40分钟。
(注意:电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。
文献报道为18~50 V ,200~300 mA ,20~40 min。我们采用25 V ,300 mA ,30min ,效果良好。
电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定)
7. 染色
电泳结束后,将玻片浸入中和液中30min,进行中和(不避光)。
取出后每片滴加20μl 20-30μg/ml的EB染色15~20min,盖上盖玻片在荧光显微镜下观
察。

样品应置4℃环境下进行,以抑制或降低核酸内切酶等活性,阻止DNA损伤的修复。
以上除中和及染色外,各步均应在暗处进行,以避免额外的DNA损伤。应尽快阅片,
时间过长将导致荧光褪色。

PBS预冷
裂解液4℃预冷
冻冰
低溶点0.6%琼脂糖液37℃水浴锅中温育。
正常溶点0.6%琼脂糖液37℃水浴锅中温育。