分子荧光和磷光分析法
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3
荧光和磷光体系能级示意图
4
激发光谱和发射光谱
Ê 激发光谱：物质分子选择性地吸收某一波段
的光产生的光谱。激发光谱为荧光强度与激发波 长的关系曲线。
Ê 发射光谱：受激发光照射时，荧光（磷光）
物质发射的光谱。如果固定激发光波长为激发光 谱峰值所对应的波长，然后测定不同波长时所发 射的荧光（或磷光）强度，即得荧光（磷光）光 谱曲线。
定量分析关系式
If = 2.3 ϕ I0 ε l c
浓度
荧
光 量
样品池厚度
子 效
吸光系数
率 入射光强度
发射光量子数
ϕ = 吸收光量子数 ≤ 1
1) 增加入射光强度，荧光强度增加
2)
If = Kc
只有在极稀溶液中，即ε l c < 0.05，
If与c方呈线性关系
苯酚的荧光标准曲线
荧光法的灵敏度比分光光度法高2~4个数量级
荧光 样品池
发射光 单色器
检测系统
荧光光度计示意图
Ø 光源与检测器呈90度角，以避开激发 光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。
I0
It
If
荧光 检测器
紫外－可见 检测器
Ø样品池 四面透光
Ø 分光系统(双单色器)
激发光单色器作用：选择激发波长
发射光单色器作用：分离出荧光发射波长
荧光和磷光分析法的应用
荧光定量分析的步骤： 1)绘制激发光谱和发射光谱，根据光谱曲线确定 最大激发光波长(λex)和最大发射波长(λem)作为 工作波长。 2)确定适宜的分析条件：溶剂、试剂浓度、pH、 温度等。 3)采取工作曲线法或比率法与标准溶液的荧光强 度比较，测得未知样品中待测组分的浓度
11
荧光光谱仪
光 源
激发光 单激 色器 发
在分析化学方面的应用
1)直接测定能产生荧光的物质
2)衍生化后测定能与荧光试剂反应 生成荧光化合物的物质
3)荧光淬灭法测定荧光淬灭剂
4)固体表面室温磷光方法测定稠环 芳烃和杂环化合物的快速灵敏分析 手段
高灵敏度、高选择性
16
ϕ
苯
0.07
萘
0.29
λ/nm 283 321
Байду номын сангаас
蒽
0.46
400
一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率
越高，且荧光光谱红移。
H CC H
H
H
CC
强荧光
无荧光
3) 刚性平面结构
O
O
-O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光素(强荧光)
刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶 剂和其它溶质分子的相互作用减小，因而有利 于提高荧光效率。
第9章 分子荧光和磷光分析法
9.1.1 光致发光的基本原理 9.1.2 分子光致发光与结构间的关系 9.1.3 荧光强度的影响因素及测定步骤 9.1.4 荧光（磷光）光谱仪 9.1.5 荧光和磷光分析法的应用
1
光致发光的基本原理
荧光现象的发现
2
Excitation and emission spectra of anthracene
荧光和分子结构的关系
1) 跃迁类型
激发 π → π *, n → π *
π * → π , π * → n 发射
与n → π *跃迁相比，π → π *跃迁的 ε 大100
~ 1000倍，寿命较短，通过系间窜跃至三重 态的速率也较小，因此 π * → π 跃迁的荧光 效率较高。
2) 共轭效应
化合物
4) 取代基效应
化合物
荧光相对强度
苯
10
苯酚
OH
18
苯胺
NH2
20
苯甲酸
COOH
3
硝基苯
NO2
0
Ê 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等， 增强荧光。
Ê 吸电子基团：如–COOH, C O , –NO2, –NO等， 减弱甚至熄灭荧光。
荧光强度的影响因素和测定步骤
荧光强度除与分子结构有关，还受很多因素影响： 1)光源强度 2)样品浓度 3)溶剂的影响 4)pH的影响 5)温度的影响
荧光和磷光体系能级示意图
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激发光谱和发射光谱
Ê 激发光谱：物质分子选择性地吸收某一波段
的光产生的光谱。激发光谱为荧光强度与激发波 长的关系曲线。
Ê 发射光谱：受激发光照射时，荧光（磷光）
物质发射的光谱。如果固定激发光波长为激发光 谱峰值所对应的波长，然后测定不同波长时所发 射的荧光（或磷光）强度，即得荧光（磷光）光 谱曲线。
定量分析关系式
If = 2.3 ϕ I0 ε l c
浓度
荧
光 量
样品池厚度
子 效
吸光系数
率 入射光强度
发射光量子数
ϕ = 吸收光量子数 ≤ 1
1) 增加入射光强度，荧光强度增加
2)
If = Kc
只有在极稀溶液中，即ε l c < 0.05，
If与c方呈线性关系
苯酚的荧光标准曲线
荧光法的灵敏度比分光光度法高2~4个数量级
荧光 样品池
发射光 单色器
检测系统
荧光光度计示意图
Ø 光源与检测器呈90度角，以避开激发 光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。
I0
It
If
荧光 检测器
紫外－可见 检测器
Ø样品池 四面透光
Ø 分光系统(双单色器)
激发光单色器作用：选择激发波长
发射光单色器作用：分离出荧光发射波长
荧光和磷光分析法的应用
荧光定量分析的步骤： 1)绘制激发光谱和发射光谱，根据光谱曲线确定 最大激发光波长(λex)和最大发射波长(λem)作为 工作波长。 2)确定适宜的分析条件：溶剂、试剂浓度、pH、 温度等。 3)采取工作曲线法或比率法与标准溶液的荧光强 度比较，测得未知样品中待测组分的浓度
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荧光光谱仪
光 源
激发光 单激 色器 发
在分析化学方面的应用
1)直接测定能产生荧光的物质
2)衍生化后测定能与荧光试剂反应 生成荧光化合物的物质
3)荧光淬灭法测定荧光淬灭剂
4)固体表面室温磷光方法测定稠环 芳烃和杂环化合物的快速灵敏分析 手段
高灵敏度、高选择性
16
ϕ
苯
0.07
萘
0.29
λ/nm 283 321
Байду номын сангаас
蒽
0.46
400
一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率
越高，且荧光光谱红移。
H CC H
H
H
CC
强荧光
无荧光
3) 刚性平面结构
O
O
-O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光素(强荧光)
刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶 剂和其它溶质分子的相互作用减小，因而有利 于提高荧光效率。
第9章 分子荧光和磷光分析法
9.1.1 光致发光的基本原理 9.1.2 分子光致发光与结构间的关系 9.1.3 荧光强度的影响因素及测定步骤 9.1.4 荧光（磷光）光谱仪 9.1.5 荧光和磷光分析法的应用
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光致发光的基本原理
荧光现象的发现
2
Excitation and emission spectra of anthracene
荧光和分子结构的关系
1) 跃迁类型
激发 π → π *, n → π *
π * → π , π * → n 发射
与n → π *跃迁相比，π → π *跃迁的 ε 大100
~ 1000倍，寿命较短，通过系间窜跃至三重 态的速率也较小，因此 π * → π 跃迁的荧光 效率较高。
2) 共轭效应
化合物
4) 取代基效应
化合物
荧光相对强度
苯
10
苯酚
OH
18
苯胺
NH2
20
苯甲酸
COOH
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硝基苯
NO2
0
Ê 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等， 增强荧光。
Ê 吸电子基团：如–COOH, C O , –NO2, –NO等， 减弱甚至熄灭荧光。
荧光强度的影响因素和测定步骤
荧光强度除与分子结构有关，还受很多因素影响： 1)光源强度 2)样品浓度 3)溶剂的影响 4)pH的影响 5)温度的影响
