苏太猪引种试验研究

312023年40卷第8期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学主题策划F E A T U R E俗话说“猪粮安天下”，生猪产业是关乎国计民生的重要产业。

贵州省养猪历史悠久，地方猪种资源丰富，被《国家畜禽遗传资源品种名录（2021年版）》列为保护品种的有7个，在数量上名列全国前茅。

2020年，贵州省成立生猪产业发展领导小组，大力推动生猪产业发展，独具特色的贵州地方猪种发展得到空前重视。

随着社会经济发展水平的不断提高，生猪消费市场呈多元化变化，越来越多的消费者认可肉质风味俱佳的地方猪产品，逐渐摸索出产学研联动、龙头企业带动、名片宣传推动的地方猪发展模式，有力地推进贵州省地方猪产业的可持续发展。

本文以从江香猪为例浅谈贵州地方猪发展机遇与挑战。

1 贵州地方猪资源发展情况1.1品种资源贵州是我国唯一一个没有平原作为发展支撑、地形复杂多样、以山地耕地为主的省份，有“八山一水一分田”之说。

长期以来，贵州省交通不便利，各个区域相对隔绝，在当地源远流长的农耕文化与群众长期选育下，逐渐形成了一些有地方特色的猪种。

贵州省内被《国家贵州地方猪种发展的机遇与挑战—以从江香猪为例陈 敏 1，吴军权 2（1.黔东南苗族侗族自治州畜牧技术推广站，贵州 凯里 556000；2.从江县香猪产业发展中心，贵州 从江 557400）作者简介：陈敏（1985—），男，贵州台江人，硕士，高级畜牧师，研究方向：畜牧技术推广，E-mail:****************畜禽遗传资源品种名录（2021年版）》列入保护名录的猪品种有乌金猪（柯乐猪）、白洗猪、关岭猪、江口萝卜猪、黔北黑猪、黔东花猪、香猪等7个品种。

地方猪年出栏量约占生猪出栏总量的15%左右，其中又以从江香猪、黔北黑猪和柯乐猪等品种最受市场欢迎。

1.2 保种情况目前贵州省内取得种畜禽生产经营许可证的地方品种资源场有7家，其中贵州从江粤黔香猪开发有限公司经营管理的国家香猪（从江香猪）保种场（编号C5210101）为贵州省唯一的国家级保种场。

太湖猪的养殖太湖猪的养殖日期：2010-03-12 作者: 来源:1982年2月17日，在江苏省江阴县发生了一件罕见的事，一头母猪竟然产下了42只小猪仔，并且存活了40头，是什么猪有如此高超的本领呢？时隔二十多年了，我们还能找到这种猪吗？（神秘感）在碧波荡漾的太湖湖畔——著名的园林城市苏州就有这种猪，而且这种猪肉产品已经被注册了商标，猪肉生产的全过程都实行了严格的质量监控，实行专卖店销售，各专卖店统一经营模式，统一销售价格，在市场上颇受欢迎。

这种猪就是享有“国宝”美誉的二花脸猪——太湖猪的一种。

一、太湖猪的品种特征（不读）太湖猪是指原产于长江下游，江苏、浙江省和上海市交界的太湖流域一带的地方猪种。

鉴于这一带猪的生产性能基本相近，形成过程类同，特别是相互间有一定的血统交流，1973年被统称为“太湖猪”。

现在太湖猪已经成为全球著名的地方猪种，也是我国重点保护的地方猪种。

类群划分（不读）那么太湖猪都有哪些种类呢？太湖猪按产地和外形分为梅山猪、二花脸猪、嘉兴黑猪、枫泾猪、米猪、沙乌头猪、横泾猪等类群。

目前以梅山猪、二花脸猪较多。

其中，二花脸猪享有“国宝”之称，禁止出口。

外貌特征（不读）太湖猪头大额宽，额部皱褶明显，面部微微凹陷，耳大下垂，腹大下垂但不拖地，臀斜，腿瘦，皮厚，特别是公猪的皮象是量身定制的一套厚厚的盔甲。

乳房发育良好，有效乳头16个以上。

太湖猪被毛稀疏。

二花脸猪、嘉兴黑猪、枫泾猪、米猪、横泾猪为全黑或青黑色；梅山猪、沙乌头猪为完全或不完全四脚白；下腹皮肤呈现白色或紫红色。

太湖猪具有几大典型的种质特性，受到了国内外畜牧界的高度重视。

繁殖率高（不读）太湖猪的一个最大特点就是繁殖率高。

太湖猪经产母猪正常情况下一窝一产能够达到14到15头左右，而其中的二花脸一产最高纪录达到42头，这是其它猪种所无法比拟的。

肉质优（不读）太湖猪肉肉质鲜美可口。

虽然许多猪种的肉质都很优秀，但是太湖猪的肉质优体现在它的肌内脂肪含量。

苏姜猪不同杂交组合生产性能的对比试验陶勇;周春宝;赵旭庭;韩大勇;倪黎刚;经荣斌【摘要】@@%对第6世代苏姜猪肥育猪及其与长白猪、大白猪杂交后代的生产性能进行了测定.结果表明,苏姜猪第6世代肥育猪25～ 90 kg阶段,平均日增重667.26 g,料肉比3.18:1,90 kg屠宰时的屠宰率达73.19％,胴体瘦肉率56.28％,眼肌面积33.93 cm2,肌内脂肪含量达3.11％.苏姜猪与长白猪、大白猪杂交生产的商品猪也体现了较好的杂种优势,达到了优质瘦肉型猪的要求.试验数据表明,苏姜猪具有良好的经济性能,是一个较为理想的杂交母本.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)008【总页数】2页(P220-221)【关键词】苏姜猪;杂交;生产性能【作者】陶勇;周春宝;赵旭庭;韩大勇;倪黎刚;经荣斌【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏姜曲海种猪场,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏姜曲海种猪场,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏姜曲海种猪场,江苏泰州225300;扬州大学动物科技学院,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】S828.8+9苏姜猪是利用江苏省地方猪种姜曲海猪以及杜洛克、枫泾猪为亲本，采用传统育种方法与现代分子育种手段相结合的方法，历经10余年培育而成的瘦肉型母系新品种[1]。

目前，在江苏省“九五”“十五”“十一五”等科技攻关项目支持下，苏姜猪的选育已经进入第6世代，育种工作接近尾声[2]。

本研究主要测定第6世代苏姜猪的生产性能及其杂交生产情况，旨在为苏姜猪的推广利用提供参考。

1 材料与方法1.1 试验猪第6世代苏姜猪生长肥育猪56头，以及其与长白猪、大白猪的杂交后代各30头。

苏姜猪扩繁和耐粗饲试验报告
刘汉清;倪黎纲;赵旭庭
【期刊名称】《中国畜牧兽医文摘》
【年(卷),期】2015(031)012
【摘要】研究了苏姜猪在扩繁场的繁殖性状和耐粗饲性能,结果表明:苏姜猪在扩繁场具有良好的繁殖性能,初产产仔数在10.5头以上,经产仔数13.5头以上.耐粗饲试验结果表明,苏姜猪含有地方猪血统,具有我国地方猪耐粗饲的特性,在饲养过程中,使用资源丰富、价格低廉的青绿饲料,可达到降低饲养成本、提高经济效益的目的.【总页数】2页(P62-63)
【作者】刘汉清;倪黎纲;赵旭庭
【作者单位】靖江市畜牧兽医技术服务中心,江苏靖江 214500;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300
【正文语种】中文
【相关文献】
1.脱毒甘薯的扩繁与快繁 [J], 郑跃进;王其法;徐春娥;孔祥生;李友军
2.苏姜猪扩繁场建立的问题探讨 [J], 朱爱民;时玉梅
3.基于植物微扩繁器的草莓快繁技术的研究 [J], 张转转;石琨;于镇榕;郑彩霞
4.农业部副部长于康震在肉牛基础母牛扩繁工作部署视频会议上强调认真落实基础母牛扩群增量项目加快发展牛羊肉生产 [J],
5.阜平县旺泉淡水鱼繁养场取得良种扩繁和成鱼饲养双丰收 [J], 顾国清
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苏太猪简介
施增斌;华金弟;沈家林
【期刊名称】《养殖技术顾问》
【年(卷),期】2003(000)007
【摘要】@@ 苏太猪全身被毛黑色、偏淡,耳中等大而垂向前下方,头面有清晰皱纹,嘴中等长而直,部分有玉鼻,四肢结实,背腰平直,腹小,后躯丰满,身体各部位发育正常,具有明显的瘦肉型猪特征.
【总页数】1页(P7-7)
【作者】施增斌;华金弟;沈家林
【作者单位】江苏省苏州市苏太猪育种中心,215128;江苏省苏州市苏太猪育种中心,215128;江苏省苏州市苏太猪育种中心,215128
【正文语种】中文
【中图分类】S828
【相关文献】
1.苏太猪在鞍山地区的引进与推广情况简介 [J], 金文英;
2.中国瘦肉型猪新品种——苏太猪 [J], 庄庆士;梁伟东;丛树发;陈国福;师庆伟
3.苏太猪与野猪×苏太杂交猪的生产性能测定 [J], 潘祖荫
4.巴克夏猪与莱芜猪和苏太猪及其杂种F1代猪肥育性能测定 [J], 包高良;王玉安;刘孟洲;秦学春
5.苏太猪在鞍山地区的引进与推广情况简介 [J], 金文英
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实行保种与开发相结合，建好太湖猪种质资源基因库王子林 华金弟 黄雪根 沈家林苏州市苏太猪育种中心对动物遗传资源保存具有重要的社会价值和经济价值，是培育优势畜产品产业的源头和基础，因此，对于动物遗传资源的保护，应该象对待国家文化遗产一样给予高度的重视。

对于动物遗传资源的保存，严格地讲，就是要保存动物种群的基因库。

根据动物遗传学的基本原理，为了在整体上保持一个动物品种的遗传结构，一般采取通过建立保种群，进行活体保存，即原位保存。

苏州市对于优良地方猪种—太湖猪的保护与开发利用开展了多方面的工作，在70年代，建立了县级种猪场；在80年代，由于太湖猪生长速度慢、瘦肉率低等缺点，根据市场发展需要，开始利用太湖猪着手培育新品种，并于1999年培育成功了苏太猪；21世纪初，苏太猪育种中心通过调查研究、专家论证等，根据形势发展的需要，建立了以梅山猪、二花脸猪、枫泾猪三个类群为主的太湖猪活体基因库，同时在猪的基因库建设和开发利用方面开展了很多基础性工作。

苏州市苏太猪育种中心由于拥有苏太猪原种场和太湖猪原种场，其中苏太猪原种场为全国唯一的原种场，因此，2004年，中心被江苏省农林厅授牌为全省首批唯一的“猪种质资源基因库”单位。

在入选江苏省猪种质资源基因库以后，又进一步加快了步伐，目前我们对猪种质资源采用活体保存，虽然成本较高，但在现有条件下比较稳妥可靠，而且可以在保存的同时，进行不断选育和开发利用，使猪种资源发挥它应有的作用,并降低保存成本。

1通过建立国营种猪场和“活体基因库”， 保护世界最高产猪种我国的太湖猪不仅产仔数多，而且具有耐粗饲、性情温驯、肉质鲜美、杂种优势显著等优点，是提高世界猪种繁殖力和改善猪肉品质的宝贵高产遗传资源，又是养猪业中用作经济杂交和合成配套品系的优良母本，享有国宝之称，因而受到了国内外畜牧界的高度重视图1显示了太湖猪的高产仔性能。

美国、英国、泰国、日本、朝鲜、法国、匈牙利、阿尔巴尼亚、罗马尼亚等9个国家都已引进太湖猪，并开展了高繁殖性能及杂交利用等多项研究。

苏太猪FUT1基因多态性及其与生产性能的关联分析孙鹏翔;吴圣龙;包文斌;李碧春;陈国宏【期刊名称】《中国畜牧杂志》【年(卷),期】2007(43)5【摘要】采用PCR-RFLP方法对苏太猪FUT1基因多态性进行分析.结果表明:苏太猪FUT1基因开放阅读框307位点经Hin6 I酶切后,产生GG型和AG型,不存在抗性纯合子AA型.分析这两种基因型与苏太猪生产性能间的相关性,结果表明:AG型个体平均生产性能均高于GG型个体,且AG型个体的1胎断奶窝重、2胎断奶窝重、3胎总产仔数和6胎断奶窝重显著(p＜0.05)高于GG型个体,对一些生产性状而言,AG型是有益基因型.【总页数】3页(P4-6)【作者】孙鹏翔;吴圣龙;包文斌;李碧春;陈国宏【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州,225009;安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥,230036;扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.苏太猪与野猪×苏太杂交猪的生产性能测定 [J], 潘祖荫2.苏太猪抗F18+大肠杆菌病基础群FUT1基因多态性及其与生长发育的关联分析[J], 叶兰;潘章源;黄雪根;华金第;吴圣龙;包文斌3.苏太猪ESR基因多态性及其与繁殖性能的关联分析 [J], 黄雪根;叶兰;刘楷;华金第;包文斌;吴圣龙4.苏太猪SLA-DQA基因多态性及其与生产性能的关联分析 [J], 吴圣龙;鞠慧萍;包文斌;李碧春;陈国宏;杨建生;黄雪根;华金弟5.大白猪FUT1和PRLR基因多态性与产仔性状的关联分析 [J], 谢苏;孙晓梅;孙义姗;黄涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(４):１０３６￣１０４２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ赵为民ꎬ戴超辉ꎬ陈㊀哲ꎬ等.ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(４):１０３６￣１０４２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０４.０１３ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因赵为民１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀戴超辉１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀陈㊀哲１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀涂㊀枫１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀李㊀辉１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀付言峰１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀李碧侠１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀任守文１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀程金花１ꎬ２ꎬ３(１.江苏省农业科学院畜牧研究所ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.江苏省农业种质资源保护与利用平台ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ３.农业农村部种养结合重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣０８￣１９基金项目:江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[ＪＢＧＳ(２０２１)０９９]ꎻ扬州市重点研发项目(现代农业)(ＹＺ２０２１０３７)ꎻ国家生猪产业技术体系项目(ＣＡＲＳ￣ＰＩＧ￣３５)ꎻ江苏省农业重大新品种创制项目(ＰＺＣＺ２０１７３３)作者简介:赵为民(１９８３－)ꎬ男ꎬ湖北钟祥人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事猪抗病育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｏ＿ｗｅｉｍｉｎ１９８３＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍ通讯作者:程金花ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｈｃｈｅｎｇ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀本研究利用ＲＴ￣ＰＣＲ检测ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因表达在细胞中的亚定位ꎬ采用５ᶄＲＡＣＥ获得ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的转录起始位点ꎻ利用ＣＲＩＳＰＯＲ软件对－３００~０ｂｐ区域的ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子序列设计ｓｇＲＮＡ并构建到ｐｘ３３０载体ꎬ通过转染细胞与Ｔ７Ｅ１酶切验证ｓｇＲＮＡ效率ꎻ利用酶切和亚克隆方法将ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ片段替换ｐｘ３３０载体的Ｃａｓ９序列ꎬ形成重组ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎻ将验证有效的ｓｇＲＮＡ构建到ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎬ形成ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎮ添加不同质量浓度的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理细胞ꎬ以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度ꎮ转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体并用ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄ后进行ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达检测ꎬ同时对ｓｇＲＮＡ在ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子上的结合位点进行Ｓａｎｇｅｒ测序ꎬ以进一步验证上述结合位点是否发生切割ꎮ结果显示ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１主要表达于细胞核ꎬ而在细胞质中几乎不表达ꎮ５ᶄＲＡＣＥ获得了Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１５ᶄ端大约２７０ｂｐ的序列ꎮｑＰＣＲ检测结果显示ꎬ与对照组相比ꎬｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２能够显著抑制Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达(Ｐ<０ ０５)ꎮＳａｎｇｅｒ测序结果表明ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２所在的位点并没有发生碱基缺失和插入ꎮ研究结果为后续进一步研究ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在先天性免疫反应中的功能奠定了基础ꎮ关键词:㊀ＣＲＩＳＰＲꎻｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎻＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因ꎻ猪ꎻ基因沉默中图分类号:㊀Ｓ８５２.２８㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０４￣１０３６￣０７ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｐｉｇＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｂｙＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｓｙｓｔｅｍＺＨＡＯＷｅｉ￣ｍｉｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＤＡＩＣｈａｏ￣ｈｕｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＺｈｅ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＴＵＦｅｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＨｕｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＦＵＹａｎ￣ｆｅｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＢｉ￣ｘｉａ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＲＥＮＳｈｏｕ￣ｗｅｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＧＪｉｎ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ３(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＪｉａｎｇｓｕＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎＰｌａｔｆｏｒｍꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐａｎｄＬｉｖｅｓｔｏｃｋＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｓｕｂ￣ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲ.ＡｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｉｔｅｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｗａｓｏｂ￣ｔａｉｎｅｄｂｙ５ᶄＲＡＣＥ.ＴｈｅＣＲＩＳＰＯＲｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅ￣ｓｉｇｎｔｈｅｓｇＲＮＡｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｗｉｔｈｉｎ－３００~０ｂｐｒｅｇｉｏｎ.ＴｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｓｇＲＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｐｘ３３０ꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓｇＲＮＡｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓａｎｄＴ７Ｅ１ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ.Ｃａｓ９ｆｒａｇ￣ｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｘ３３０ｖｅｃｔｏｒｗａｓｒｅｐｌａｃｅｄｂｙｔｈｅｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣６３０１ＢＳＤｆｒａｇｍｅｎｔｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇｔｏｆｏｒｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒ.ＩｔｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｇＲＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒｔｏｆｏｒｍｔｈｅｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒ.ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ.Ａｎｄｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｍｉｎｉ￣ｍｕｍｌｅｔｈａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓ.ＡｆｔｅｒｓｅｖｅｎｄａｙｓｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｅｌｌｓｗｉｔｈＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ.ＭｅａｎｗｈｉｌｅꎬｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｏｆｓｇＲＮＡｏｎｔｈｅＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｆｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｙｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅａｂｏｖｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｗａｓｃｌｅａｖｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｗａｓｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓꎬｂｕｔｈａｒｄｌｙｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ.Ｔｈｅ５ᶄＲＡＣＥｏｂｔａｉｎｅｄａｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２７０ｂｐａｔｔｈｅ５ᶄｅｎｄｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１.ＴｈｅｑＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１(Ｐ<０.０５).ＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓａｔｔｈｅｓｉｔｅｓｗｈｅｒｅｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＣＲＩＳＰＲꎻｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎻＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅꎻｐｉｇꎻｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ㊀㊀长链非编码ＲＮＡ(Ｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡꎬＬｎ￣ｃＲＮＡ)是一类本身不编码蛋白㊁转录本长度超过２００ｂｐ的ＲＮＡꎮ研究结果表明ＬｎｃＲＮＡ参与了Ｘ染色体失活㊁胚胎发育㊁基因印记㊁癌症㊁免疫等各种细胞生命活动[１￣５]ꎮ近年来大量畜禽相关的ＬｎｃＲＮＡ被鉴定出来ꎬ这些ＬｎｃＲＮＡ紧密参与了畜禽肌肉发育㊁免疫调控㊁繁殖等重要性状[６￣９]ꎬ注释和解析这些ＬｎｃＲＮＡ的功能对进一步挖掘调控畜禽重要经济性状的功能元件具有深远意义ꎮ然而大多数ＬｎｃＲＮＡ定位于细胞核ꎬ而ＲＮＡｉ的工作系统主要在细胞质中发挥作用ꎬ对定位于细胞核的ＬｎｃＲＮＡ作用非常有限[１０￣１２]ꎬ这限制了ＬｎｃＲＮＡ的功能解析ꎮＣＲＩＳＰＲｉ系统通过核酸酶活性失活的Ｃａｓ９(ｄＣａｓ９)和ｓｇＲＮＡ的复合物结合到某个基因的转录起始位点(ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅꎬＴＳＳ)附近ꎬ物理性阻碍ＲＮＡ聚合酶的通过ꎬ从而导致基因沉默[１３]ꎮ通过ｄＣａｓ９融合基因抑制结构域如ＫＲＡＢ(Ｋｒüｐｐｅｌ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｏｘ)ꎬ形成ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ复合结构ꎬ可进一步提高转录抑制的效率[１４￣１６]ꎮＬｉｕ等[１７]利用ＣＲＩＳＰＲｉ系统鉴定了数百个与细胞生长相关的Ｌｎ￣ｃＲＮＡꎬＫｌａｎｎ等[１８]利用ＣＲＩＳＰＲｉ系统鉴定了大量与基因表达调控相关的功能元件ꎮＣＲＩＳＰＲｉ系统在抑制基因表达上也呈现出较强的特异性[１９￣２０]ꎬ是研究ＬｎｃＲＮＡ功能的新一代工具ꎮＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１是在研究肌细胞分化时发现的一个长链非编码ＲＮＡ[２１]ꎬ其作为核心组分主要参与细胞亚结构旁斑(Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ)的形成ꎬ在细胞分化ꎬ癌症发生和病毒感染等生物学过程中发挥着重要作用[２１￣２３]ꎮ本课题组前期研究结果表明猪Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因在脂蛋白刺激下表达显著上调ꎬ表明其在Ｔｏｌｌ样受体２(ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＴＬＲ２)介导的先天性免疫反应中可能起到调控作用[２４]ꎮ本研究利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统来抑制Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达ꎬ为后续进一步研究其在先天性免疫反应中的功能奠定基础ꎮ１㊀材料和方法１.１㊀细胞、菌株与质粒Ｔｒａｎｓ５ａ感受态菌株购于北京擎科生物科技有限公司ꎬＬｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体由华中农业大学赵长志惠赠ꎬ猪ＰＫ１５细胞㊁ｐｘ３３０载体由本实验室保存ꎮ１.２㊀试剂ＲＮＡ提取试剂盒购于南京诺唯赞医疗科技有限公司ꎻＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＮＡｍａｒｋｅｒ购于北京擎科生物科技有限公司ꎻ内切酶ＢｂｓＩ㊁Ｔ７Ｅ１酶购于ＮＥＢ公司ꎻＰＣＲ酶㊁Ｔ载体㊁末端转移酶ＴｄＴ㊁Ｔ４连接酶㊁ｑＰＣＲ试剂㊁反转录试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司ꎻ无内霉毒素质粒试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司ꎻＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳＨＣｌ(灭瘟素Ｓ)购于南京碧云天生物技术有限公司ꎻＤＮＡ纯化回收试剂盒购于ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈＺｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ＿安诺伦(北京)生物科技有限公司公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁青链霉素购于武汉博士德生物工程有限公司ꎻ胎牛血清购于ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ(ＢＩ)公司ꎻｏｐｔｉ￣ＭＥＭ和ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司ꎮ１.３㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的亚细胞表达分布待细胞密度长至８０％左右ꎬ胰酶消化细胞ꎬ用预冷７３０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因ＰＢＳ清洗两遍后加入ＢｕｆｆｅｒＡ(１０ｍｍｏｌ/Ｌｔｒｉｓ￣ｃｌꎬ１０ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ０ ５％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ￣６３０)ꎬ冰上放置５ｍｉｎꎬ离心后上清液用于细胞质ＲＮＡ的提取ꎮ用ＢｕｆｆｅｒＡ洗涤沉淀２次ꎬ沉淀用于细胞核ＲＮＡ的提取ꎮ１.４㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的５ᶄ末端快速扩增(５ᶄＲＡＣＥ)㊀㊀基于前期测序获得部分序列结果[２４]ꎬＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的５ᶄ末端快速扩增过程如下:利用ｏｌｉ￣ｇｏｄＴ反转录ｃＤＮＡ第一链ꎬ然后再利用ＴｄＴ酶进行５ᶄ末端ｄＣ￣ｔａｉｌｉｎｇꎬ回收纯化后ꎬ用引物５Ｐ(５ᶄ￣ＡＡＧ￣ＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ￣３ᶄ)和５ᶄ末端的特异性引物５ᶄＧＳＰ(５ᶄ￣ＣＴＧＣＣＴＣ￣ＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧ￣３ᶄ)扩增其５ᶄ末端ꎮＰＣＲ扩增条件:９５ħ５ｍｉｎꎬ９５ħ３０ｓꎬ６５ħ(－０.５ħ)４５ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ１５个循环ꎻ９５ħ１ｍｉｎꎬ６０ħ４５ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ２０个循环ꎻ７２ħ３ｍｉｎꎮ扩增的ＰＣＲ产物经过ＤＮＡ纯化回收后与Ｔ载体连接ꎬ然后转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证ꎮ１.５㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子区域的ｓｇＲＮＡ设计㊀㊀针对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子区(－３００~０ｂｐ)利用ＣＲＩＳＰＯＲ(ｈｔｔｐ://ｃｒｉｓｐｏｒ.ｔｅｆｏｒ.ｎｅｔ/)在线设计２对ｓｇＲＮＡꎮ设计原则为选取ｃｆｄＳｐｅｃＳｃｏｒｅ>８０ꎬＤｏｅｎｃｈᶄ１６￣Ｓｃｏｒｅ>５０的ｓｇＲＮＡꎮ１.６㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ质粒构建依据ｓｇＲＮＡ的序列合成反向互补的单链寡核苷酸ｓｇＦ和ｓｇＲꎬ并在ｓｇＦ的５ᶄ端添加ＣＡＣＣＧꎬ在ｓｇＲ的５ᶄ端添加ＡＡＡＣꎮ９５ħ变性５ｍｉｎꎬ室温冷却ꎬ使ｓｇＦ和ｓｇＲ退火互补ꎮＢｂｓⅠ酶切ｐｘ３３０载体ꎬ回收纯化后与退火的寡核苷酸连接ꎬ转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证与无内霉毒素质粒提取ꎮ１.７㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体构建通过酶切ｐｘ３３０载体ꎬ将Ｃａｓ９序列替换为多克隆位点ꎬ然后再将ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ插入到该多克隆位点ꎮ具体方法如下:首先以ｐｘ３３０载体为模板ꎬ通过引物Ｆ:５ᶄ￣ＴＴＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣ￣ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡ￣３ᶄ和Ｒ:５ᶄ￣ＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴ￣３ᶄ进行ＰＣＲ扩增ꎮＰＣＲ产物包含引入了多个酶切位点(引物Ｆ下划线部分)的ｂＧＨｐｏｌｙ(Ａ)片段ꎮ然后对ＰＣＲ产物和ｐｘ３３０载体分别进行ＡｇｅⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切并进行连接ꎬ转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证与质粒提取ꎮ此重组后的载体为ｐｘ３３０￣ＭＣＳꎮ将筛选好的ｓｇＲＮＡ先构建到ｐｘ３３０￣ＭＣＳꎬ为ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳꎮ然后对ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳ和Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ进行ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎬ将Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体中的ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ连接到ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳ中ꎬ形成重组载体ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎮ１.８㊀ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度摸索猪ＰＫ１５细胞铺板１２孔板ꎬ２４ｈ后待细胞密度达到８０％左右ꎬ分别添加０μｇ/ｍｌ㊁１μｇ/ｍｌ㊁３μｇ/ｍｌ㊁４μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎬ每个质量浓度处理３次重复ꎬ每２ｄ换１次ꎬ在第７ｄ时观察细胞的死亡情况ꎬ使细胞致死的最小剂量为后续的药筛质量浓度ꎮ１.９㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的沉默猪ＰＫ１５细胞在转染前１ｄ铺１２孔板ꎬ转染时密度大约７０％ꎮ对照组转染ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎬ实验组分别转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ１￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ和ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ２￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ质粒ꎬ４８ｈ后ꎬ利用ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄ后进行ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达检测ꎮ１.１０㊀定量ＰＣＲ１μｇＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎬ使用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５进行ｑＰＣＲ扩增ꎮ对照组与试验组各３个生物学重复ꎬ每个样品重复３次ꎮ采用三步法扩增ꎬ程序简要如下:预变性９５ħ２ｍｉｎꎬ９５ħ１５ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ４０个循环ꎮ数据均以平均值ʃ标准差表示ꎮ使用单因素方差分析各组之间的差异显著性ꎮ引物序列见表１ꎮ表１㊀引物序列信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ基因㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增长度(ｂｐ)ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１Ｆ:ＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＧ６０１６５Ｒ:ＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＨＰＲＴＦ:ＣＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡ６０１９１Ｒ:ＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣ２㊀结果与分析２.１㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达的亚细胞定位利用低渗溶液将细胞总ＲＮＡ分为细胞质和细８３０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期胞核ＲＮＡꎬＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达于细胞核ꎬ在细胞质中几乎不表达(图１)ꎮＨＰＲＴ作为细胞内参基因ꎬ其在细胞核内转录后会向细胞质中运输ꎬ其ｍＲＮＡ在细胞质中的表达量多于细胞核ꎮ图１结果显示ＨＰＲＴ在细胞质的表达量高于细胞核ꎬ符合其表达定位ꎮ图１㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在细胞质与细胞核中的表达Ｆｉｇ.１㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓ２.２㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１转录起始位点为了确定ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的转录起始位点ꎬ通过５ᶄＲＡＣＥ对其５ᶄ端序列进行了克隆ꎬ图２结果显示得到大约２７０ｂｐ的条带ꎬ与预期相符ꎮ图２㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的５ᶄＲＡＣＥ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀５ᶄＲＡＣＥａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１２.３㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区的ｓｇＲＮＡ设计与效率验证㊀㊀通过ＣＲＩＳＰＯＲ在线设计程序ꎬ对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区(－３００~０ｂｐ)设计了２对ｓｇＲＮＡꎬ分别为ｓｇＲＮＡ１:５ᶄ￣ＣＣＧＡＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡ￣３ᶄꎬＰＡＭ为ＧＧＧꎬ位置约－２００ｂｐꎬＤｏｅｎｃｈ１６￣Ｓｃｏｒｅ参数为６３ꎻｓｇＲＮＡ２:５ᶄ￣ＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴ￣ＧＡＣＧ￣３ᶄꎬＰＡＭ为ＣＧＧꎬ位置约－１５０ｂｐꎬＤｏｅｎｃｈ１６￣Ｓｃｏｒｅ参数为６３ꎮ２.４㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体的酶切验证图３显示构建的ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ经过ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后ꎬ得到约４２００ｂｐ的ｐｘ３３０骨架和５０００ｂｐ的ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ片段ꎬ与预期相符ꎮＭ:ＤＮＡ相对分子质量标准样品ꎻ１:ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ１￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎻ２:ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ２￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎮ图３㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ质粒的酶切鉴定Ｆｉｇ.３㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｐｌａｓｍｉｄｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ２.５㊀ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度的确定图４结果显示ꎬ在加ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ培养７ｄ后ꎬ１μｇ/ｍｌ质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理的细胞只有部分细胞死亡(图４Ｂ)ꎬ而３μｇ/ｍｌ与４μｇ/ｍｌ质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理的的细胞几乎全部死亡(图４Ｃ㊁图４Ｄ)ꎬ因此在后续的筛选中ꎬＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度为３μｇ/ｍｌꎮ图４Ａ为阴性对照组ꎬ细胞生长正常ꎮ２.６㊀ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达㊀㊀细胞转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ(试验组)与ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ(对照组)３６ｈ后ꎬ添加Ｂｌａｓｔｉ￣ｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄꎬ对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达进行ｑＰＣＲ检测ꎮ结果(图５)显示ꎬ与对照组相比ꎬｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２分别使ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达下降了７３％和５５％ꎬ达到显著水平(Ｐ<０ ０５)ꎮ９３０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因Ａ:阴性对照组ꎻＢ:１μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎻＣ:３μｇ/ｍｌ的Ｂｌａｓｔｉｃｉ￣ｄｉｎＳꎻＤ:４μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎮ图４㊀不同质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ对细胞的致死效果Ｆｉｇ.４㊀ＴｈｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢｌａｓｔｉｃｉ￣ｄｉｎＳｏｎｃｅｌｌｓ∗表示与对照组相比差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ图５㊀ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的沉默效果Ｆｉｇ.５㊀ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｏｎＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅ２.７㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区的切割验证为了进一步验证ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统中的ｓｇＲＮＡ是否会切割其结合位点ꎬ利用Ｓａｎｇｅｒ测序对ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２的结合位点进行分析ꎮ结果(图６)显示试验组中ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２的结合位点和对照组一致ꎬ其序列没有发生碱基缺失或者插入ꎮ３㊀讨论近年来随着重测序以及功能基因组学的发展ꎬ猪相关的ＬｎｃＲＮＡ与增强子等被大量鉴定出来[６ꎬ２５]ꎮＣＲＩＳＰＲｉ与ＲＮＡｉ和ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９敲除相比ꎬ在研究细胞核内相关的ＬｎｃＲＮＡ或表达增强子(Ｅｎｈａｎｃｅｒ￣ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡｓꎬｅＲＮＡｓ)上有着较大优势[１２ꎬ１５]ꎬ并且也可以进行高通量的筛选研究ꎬ为解析猪功能基因组以及挖掘重要调控元件奠定基础ꎮＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在最初发现时定位于小鼠肌细胞核内ꎬ作为核心组分主要参与细胞亚结构旁斑(Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ)的形成[２１]ꎮ本试验发现猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１几乎只表达于细胞核ꎬ表明ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达定位在物种间相对保守ꎮ由于Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体较大(约１４ｋｂ)ꎬ如果再联合转染ｓｇＲＮＡ表达载体ꎬ会导致转染效率低ꎬ从而会影响基因沉默效果ꎮ本研究通过酶切与亚克隆构建了ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ这种 Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ 载体ꎬ将ｓｇＲＮＡ和ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ表达元件都整合到一个载体ꎬ大幅度缩减了载体ꎬ提高了表达效率[２６￣２７]ꎬ从而进一步提升沉默效果ꎮ位于ＴＳＳ不同位置的ｓｇＲＮＡ对ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ的沉默效果具有决定性作用[１５ꎬ２８]ꎮ因此本研究首先利用５ᶄＲＡＣＥ确定了ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的ＴＳＳꎮ由于大多数编码ＬｎｃＲＮＡ基因ꎬ其表达水平相对于编码蛋白基因较低[２９￣３１]ꎬ确定这些重要而表达水平较低的ＬｎｃＲＮＡ的ＴＳＳ并不容易ꎬ这也是利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默ＬｎｃＲＮＡ一个限制因素ꎮＴＳＳ附近启动子区对基因表达水平有重要影响ꎬ其区域内碱基的删除或插入会影响其基因的表达[３２￣３４]ꎮ尽管ｄＣａｓ９呈现失活的状态ꎬ并不会切割ｓｇＲＮＡ的结合位点[１３]ꎬ为了进一步验证ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达下调不是由于ｓｇＲＮＡ切割ＴＳＳ附近启动子区造成的ꎬ本研究利用Ｓａｎｇｅｒ测序对试验组ｓｇＲＮＡ的结合位点进行序列分析ꎬ结果显示其结合位点并没有发生删除或者插入ꎬ表明ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达下调是通过ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统来实现ꎮ本研究获得了ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的ＴＳＳ位点ꎬ在其附近启动子区设计并验证了２对有效ｓｇＲＮＡꎬ通过构建 Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ 载体ꎬ利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统有效沉默了猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达ꎮ参考文献:[１]㊀ＬＯＤＡＡꎬＨＥＡＲＤＥ.ＸｉｓｔＲＮＡｉｎａｃｔｉｏｎ:ｐａｓｔꎬｐｒｅｓｅｎｔꎬａｎｄｆｕ￣ｔｕｒｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔꎬ２０１９ꎬ１５(９):ｅ１００８３３３. [２]㊀ＫＵＡＮＧＬＤꎬＬＥＩＭꎬＬＩＣＹꎬｅｔａｌ.Ｗｈｏｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓａｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｅｍｂｒｙｏｍｏｒｐｈｏ￣ｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｒａｂｂｉｔｓ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２０ꎬ１１２(３):２２０３￣２２１２.０４０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图６㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区ｓｇＲＮＡ结合位点的Ｓａｎｇｅｒ测序峰图Ｆｉｇ.６㊀ＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｅａｋｍａｐｏｆｓｇＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｐｉｇＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１[３]㊀ＭＡＣＤＯＮＡＬＤＷＡꎬＭＡＮＮＭＲＷ.ＬｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌｉｔｙｉｎｉｍｐｒｉｎｔｅｄｄｏｍａｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔꎬ２０２０ꎬ１６(８):ｅ１００８９３０.[４]㊀ＬＩＵＢꎬＳＵＮＬꎬＬＩＵＱꎬｅｔａｌ.ＡｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＮＦ￣κＢｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｂｌｏｃｋｓＩκＢｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ２７(３):３７０￣３８１.[５]㊀ＸＵＨꎬＪＩＡＮＧＹꎬＸＵＸꎬｅｔａｌ.ＩｎｄｕｃｉｂｌｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡｓｒｏｓ１ｐｒｏｍｏｔｅｓＩＦＮ￣γ￣ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｓｂｙｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｓｔａｔ１ｍＲＮＡ[Ｊ].ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１９ꎬ２０(１２):１６２１￣１６３０.[６]㊀ＪＩＮＬꎬＴＡＮＧＱꎬＨＵＳꎬｅｔａｌ.ＡｐｉｇＢｏｄｙＭａｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｒｅ￣ｖｅａｌｓｄｉｖｅｒｓｅｔｉｓｓｕｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):３７１５.[７]㊀ＧＡＯＪꎬＰＡＮＹꎬＸＵＹꎬｅｔａｌ.Ｕｎｖｅｉｌｉｎｇｔｈｅｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｐｒｏｆｉｌｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ￣ｉｎ￣ｆｅｃｔｅｄｐｏｒｃｉｎｅａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ２２(１):１７７.[８]㊀ＬＩＵＪꎬＺＨＯＵＹꎬＨＵＸꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｐｒｏｆｉｌｅｏｆＬｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｄｕｒｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ２０２１ꎬ１２:６６０３７０.[９]㊀ＤＵＺＱꎬＥＩＳＬＥＹＣＪꎬＯＮＴＥＲＵＳＫꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｐｅ￣ｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｐｉｇｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓｕｓｉｎｇＲＮＡ￣ｓｅｑ[Ｊ].ＡｎｉｍＧｅｎｅｔꎬ２０１４ꎬ４５(２):１９８￣２０４.[１０]ＤＥＲＲＩＥＮＴꎬＪＯＨＮＳＯＮＲꎬＢＵＳＳＯＴＴＩＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＧＥＮＣＯＤＥｖ７ｃａｔａｌｏｇｏｆｈｕｍａｎｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ:ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｒｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２０１２ꎬ２２(９):１７７５￣１７８９.[１１]ＦＡＴＩＣＡＡꎬＢＯＺＺＯＮＩＩ.Ｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ:ｎｅｗｐｌａｙｅｒｓｉｎｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔꎬ２０１４ꎬ１５(１):７￣２１.[１２]ＢＯＥＴＴＣＨＥＲＭꎬＭＣＭＡＮＵＳＭＴ.Ｃｈｏｏｓｉｎｇｔｈｅｒｉｇｈｔｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｊｏｂ:ＲＮＡｉꎬＴＡＬＥＮꎬｏｒＣＲＩＳＰＲ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ５８(４):５７５￣５８５.[１３]ＱＩＬＳꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬｅｔａｌ.ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５２(５):１１７３￣１１８３.[１４]ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＭＯＲＳＵＴＬꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅ￣ｄｉａｔｅｄｍｏｄｕｌａｒＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｅｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５４(２):４４２￣４５１.[１５]ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＨＯＲＬＢＥＣＫＭＡꎬＡＤＡＭＳＯＮＢꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１４ꎬ１５９(３):６４７￣６６１.[１６]ＡＬＥＲＡＳＯＯＬＮꎬＳＥＧＡＬＤꎬＬＥＥＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔＫＲＡＢｄｏｍａｉｎｆｏｒＣＲＩＳＰＲｉａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＮａｔＭｅｔｈ￣ｏｄｓꎬ２０２０ꎬ１７(１１):１０９３￣１０９６.[１７]ＬＩＵＳＪꎬＨＯＲＬＢＥＣＫＭＡꎬＣＨＯＳＷꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲｉ￣ｂａｓｅｄｇｅ￣ｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｌｏｃｉｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ３５５(６３２０):７１１１.[１８]ＫＬＡＮＮＴＳꎬＢＬＡＣＫＪＢꎬＣＨＥＬＬＡＰＰＡＮＭꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｅｎａｂｌｅｓｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].ＮａｔＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１７ꎬ３５(６):５６１￣５６８.[１９]ＴＨＡＫＯＲＥＰＩꎬＤＩＰＰＯＬＩＴＯＡＭꎬＳＯＮＧＬꎬｅｔａｌ.ＨｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｂｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓｆｏｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｄｉｓｔａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１５ꎬ１２(１２):１１４３￣１１４９.[２０]ＭＡＮＤＥＧＡＲＭＡꎬＨＵＥＢＳＣＨＮꎬＦＲＯＬＯＶＥＢꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ１４０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｎｄｕｃｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｉＰＳＣｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２０１６ꎬ１８(４):５４１￣５５３. [２１]ＳＵＮＷＯＯＨꎬＤＩＮＧＥＲＭＥꎬＷＩＬＵＳＺＪＥꎬｅｔａｌ.Ｍｅｎｅｐｓｉｌｏｎ/ｂｅｔａｎｕｃｌｅａｒ￣ｒｅｔａｉｎｅｄｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓａｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｐｏｎｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２００９ꎬ１９(３):３４７￣３５９.[２２]ＩＭＡＭＵＲＡＫꎬＩＭＡＭＡＣＨＩＮꎬＡＫＩＺＵＫＩＧꎬｅｔａｌ.Ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄ￣ｉｎｇＲＮＡＮＥＡＴ１￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＳＦＰＱｒｅｌｏｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｔｏｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｍｅｄｉａｔｅｓＩＬ８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｐｏｎｉｍｍｕｎｅｓｔｉｍｕｌｉ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ５３(３):３９３￣４０６.[２３]ＬＩＫꎬＹＡＯＴꎬＺＨＡＮＧＹꎬｅｔａｌ.ＮＥＡＴ１ａｓａｃｏｍｐｅｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅ￣ｎｏｕｓＲＮＡｉｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃａｎｃｅｒｓ:ｒｏｌｅꎬｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ[Ｊ].ＩｎｔＪＢｉｏｌＳｃｉꎬ２０２１ꎬ１７(１３):３４２８￣３４４０.[２４]赵为民ꎬ方晓敏ꎬ涂㊀枫ꎬ等.猪单核源性巨噬细胞受ＦＳＬ￣１刺激后ｌｎｃＲＮＡｓ的鉴定与特征分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１９ꎬ３５(２):３４６￣３５６.[２５]ＺＨＡＯＹꎬＨＯＵＹꎬＸＵＹꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｉｓ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｐｉｇｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):２２１７.[２６]ＳＡＫＵＭＡＴꎬＮＩＳＨＩＫＡＷＡＡꎬＫＵＭＥＳꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ２０１４ꎬ４:５４００.[２７]ＣＥＢＯＬＡＩ.Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９Ｖｅｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌꎬ２０２１ꎬ２３５１:３２１￣３３４. [２８]ＲＡＤＺＩＳＨＥＵＳＫＡＹＡＡꎬＳＨＬＹＵＥＶＡＤꎬＭＵＬＬＥＲＩꎬｅｔａｌ.Ｏｐｔｉ￣ｍｉｚｉｎｇｓｇＲＮＡｐｏｓｉｔｉｏｎｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓꎬ２０１６ꎬ４４(１８):ｅ１４１.[２９]ＬＡＭＭＴꎬＬＩＷꎬＲＯＳＥＮＦＥＬＤＭＧꎬｅｔａｌ.ＥｎｈａｎｃｅｒＲＮＡｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｍｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉꎬ２０１４ꎬ３９(４):１７０￣１８２.[３０]ＣＨＥＮＨꎬＤＵＧꎬＳＯＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｆｒｏｍｅｎ￣ｈａｎｃｅｒｓ:ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｅｎｈａｎｃｅｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１５(３):２０１￣２０７.[３１]ＮＯＪＩＭＡＴꎬＰＲＯＵＤＦＯＯＴＮＪ.ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＬｎｃＲＮＡｂｉｏｇｅｎｅ￣ｓｉｓａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｎａｓｃｅｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０２２ꎬ２３(６):３８９￣４０６.[３２]ＡＯＹＡＧＩＮꎬＷＡＳＳＡＲＭＡＮＤＡ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｄｒｏｓｏｐｈｉｌａＴＡＦ(Ⅱ)６０[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２００１ꎬ２１(２０):６８０８￣６８１９.[３３]ＤＡＮＩＮＯＹＭꎬＥＶＥＮＤꎬＩＤＥＳＥＳＤꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ:ａｔｔｈｅｈｅａｒｔｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａꎬ２０１５ꎬ１８４９(８):１１１６￣１１３１.[３４]ＢＵＴＬＥＲＪＥꎬＫＡＤＯＮＡＧＡＪＴ.ＴｈｅＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅⅡｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ:ａｋｅｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｅｓＤｅｖꎬ２００２ꎬ１６(２０):２５８３￣２５９２.(责任编辑:成纾寒)２４０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期。

苏姜猪扩繁和耐粗饲试验报告刘汉清;倪黎纲;赵旭庭【摘要】研究了苏姜猪在扩繁场的繁殖性状和耐粗饲性能,结果表明:苏姜猪在扩繁场具有良好的繁殖性能,初产产仔数在10.5头以上,经产仔数13.5头以上.耐粗饲试验结果表明,苏姜猪含有地方猪血统,具有我国地方猪耐粗饲的特性,在饲养过程中,使用资源丰富、价格低廉的青绿饲料,可达到降低饲养成本、提高经济效益的目的.【期刊名称】《中国畜牧兽医文摘》【年(卷),期】2015(031)012【总页数】2页(P62-63)【关键词】苏姜猪;扩繁;繁殖性状;耐粗饲【作者】刘汉清;倪黎纲;赵旭庭【作者单位】靖江市畜牧兽医技术服务中心,江苏靖江 214500;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300【正文语种】中文苏姜猪是以被列入国家级畜禽遗传资源保护名录的姜曲海猪为基础，导入枫泾猪、杜洛克猪的血统，培育而成的瘦肉型新品种，是江苏省“十一五”、“十二五”重点攻关课题，其目标是使新品种在保持姜曲海猪较高繁殖力和优良肉质的基础上，进一步提高其生长速度和胴体瘦肉率。

2013年通过国家畜禽新品种审定，被列入江苏省“十三五”推广计划。

靖江市为苏姜猪养殖示范县，拥有靖江市丰园生态园有限公司、靖江市鑫旺生猪养殖专业合作社等10多个苏姜猪扩繁场和养殖示范场。

目前，示范县苏姜猪养殖推进顺利，全市苏姜猪母猪存栏达到近3 000多头。

本次试验为了更好地掌握苏姜猪的生产性状及其在不同饲养模式条件下的饲养效果，选取苏姜猪能繁母猪、保育、生长阶段猪作为试验动物，比较在不同饲养模式条件下的饲养效果，测定苏姜猪在扩繁场内的繁殖性状和耐粗饲性能，为苏姜猪规模养殖模式选择提供参考。

1.1 试验材料和方法试验苏姜猪母猪150头（苏姜猪第5代、第6代，分12个家系），公猪2头，来源于江苏姜曲海种猪场。

同一饲养条件下，专门饲养员饲养，记录苏姜猪繁殖性状数据，统计分析苏姜猪母猪繁殖性能。