酿酒酵母菌生长特性的研究_刘龙海

Abstract：To investigate the effects of temperature and pH on the growth of Saccharomyces cerevisiae，the influence of different temperature and pH were determined on Saccharomyces cerevisiae growth by single factor design. The results indicated that the temperature and pH of mediu would significantly affected the growth characteristics of Saccharomyces cerevisiae. The Saccharomyces cerevisiae growth would be inhibited when exceed the temperature （20-40 ℃） or the pH（3.0-8.0）. In this study，the optimum growth temperature of Saccharomyces cerevisiae is 25-30 ℃ ，the optimum growth pH is 4.0-6.0. This study laid a foundations for the application of fermentation process. Keywords：Saccharomyces cerevisiae；temperature；pH；growth characteristics
在前期实验中， 从奶牛饲草饲料中分离出一株有抑
第 36 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ第 3 期
营养与饲料
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菌活性的酿酒酵母菌，为了在临床上使用，本实验采用 单因素设计， 进行了培养温度和 ｐＨ 值对此酵母菌生长 特性的影响， 旨在为该酿酒酵母菌产业化开发奠定基 础。
1 材料与方法 1.1 材料 １．１．１ 菌株 酿酒酵母菌菌株 Ｙ１１， 分离自甘肃省某奶
将活化的酿酒酵母发酵液以 １％的接种量分别接种 到不同 ｐＨ 值的 ＹＥＰＤ 液体培养基中， 置 ２８℃恒温振荡 培养箱，１２０ ｒ／ｍｉｎ 培养。 分别于 １２、２０、２４ 和 ３６ ｈ 取样， 进行 １∶２０ 倍稀释后，用分光光计在 ４５０ ｎｍ 波长进行 ＯＤ 值测定， 同时取发酵液进行 ｐＨ 值测定及平板活酵母菌 计数。 １．５．２ 不 同 温 度 对 酿 酒 酵 母 菌 生 长 特 性 的 影 响 按 １％ 的接种量将活化菌液分别接种到 ＹＥＰＤ 液体培养基 中， 置恒温振荡培养箱，１２０ ｒ／ｍｉｎ ，分别在 ２０ ℃、２５ ℃、３０ ℃、 ３５ ℃、４０ ℃、４５ ℃条件下进行培养，并于 ２４ ｈ、３６ ｈ、４８ ｈ 取样进行 １∶５ 倍稀释后在波长 ４５０ ｎｍ 处测定 ＯＤ 值，同 时取样进行平板活酵母菌计数。 2 结果与分析
2.1 不同 pH 值对酿酒酵母菌生长的影响
２．１．１ 酿 酒 酵 母 菌 生 长 过 程 中 培 养 基 ｐＨ 值 的 变 化 从 图 １ 可以看出， 酿酒酵母菌在不同 ｐＨ 值的培养基中生 长时， 随培养时间的增加， 其培养液中的 ｐＨ 值逐渐降 低，一般在培养 ２０～２４ ｈ 时培养基 ｐＨ 值下降到最低，在 ３６ ｈ 时培养基 ｐＨ 值又有所上升。 培养基初始 ｐＨ 值越 高，酿酒酵母菌培养液中 ｐＨ 值下降的速度越快，当下降 至 ２．０～４．０ 时，培养液中的 ｐＨ 值趋于稳定。 详见图 １。
ｐＨ ３．０ ｐＨ ４．０ ｐＨ ４．５ ｐＨ ５．０ ｐＨ ５．５ ｐＨ ６．０ ｐＨ ６．５ ｐＨ ７．０ ｐＨ ８．０
活菌数 ＣＦＵ（ ×１０５） ＯＤ 值
2.2 不同温度对酿酒酵母菌生长的影响
从图 ３ 和图 ４ 可以看出， 温度对酿酒酵母菌的生长 有非常大的影响。 酿酒酵母菌在 ３０℃培养时生长最为迅 速，对数生长期提前，３６ ｈ 达到生长高峰期。 而温度过低 （ ２０℃） 会造成酵母菌生长缓慢，生长高峰期延后。 温 度 过高（ 超过 ４０℃） 亦会抑制酵母菌生长，造成酵母菌生长
抑制；酿酒酵母菌在培养基初始 pH 值为 4.0～6.0，温度在 25～30 ℃时生长良好。
关键词：酿酒酵母；温度；pH 值；生长特性
中图分类号：Ｓ８１６．６
文献标志码：Ａ
文章编号：２０９５－ ３８８７（ ２０１６） ０３－ ００３８－ ０４
Effects of Temperature and pH on the Growth of Saccharomyces cerevisiae
培养液中 ｐＨ 值
９
８
７
６
５
４
３
２
１
０
０
１２
２０
２４
３６
培养时间 ／ｈ 图 １ 酿酒酵母菌生长过程中培养基 ｐＨ 值变化
ｐＨ ３．０ ｐＨ ４．０ ｐＨ ４．５ ｐＨ ５．０ ｐＨ ５．５ ｐＨ ６．０ ｐＨ ６．５ ｐＨ ７．０ ｐＨ ８．０
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中国草食动物科学
2016 年
２．１．２ 培 养 基 初 始 ｐＨ 值 对 酿 酒 酵 母 菌 生 长 的 影 响 从 图 ２ 可以看出， 酿酒酵母菌培养基的初始 ｐＨ 值过低或 过高均对酵母菌的生长有明显影响。 当 ｐＨ 值为 ３．０ 或者
２５０
２００
２０℃
１５０
２５℃
１００
３０℃
５０
３５℃
４０℃
０
４５℃
６
１２
２４
３６
４８
培养时间 ／ｈ
图 ３ 温度对酿酒酵母菌生长的影响（ 活菌计数）
3 讨论 Ｗｏｏ 等 研 ［11］ 究发现 ，酿酒酵母的生长速率明显受到
环境变化的影响，其中温度和 ｐＨ 值是主要的两个方面。 温度是一种几乎可以影响细胞内所有生物化学进程的 因素 。 ［12］ 高温可使一些蛋白、ＤＮＡ、ＲＮＡ 变性，并且会影 响细胞生物膜的结构和功能 ， ［11］ 而低温会抑制细胞内参 加代谢反应酶的活性，从而影响酿酒酵母的生长。 酿酒 酵母最适生长温度为 ２８～３０℃，培养温度若高于 ４５℃，酿 酒 酵 母 会 对 温 度 非 常 敏 感 ； 培 养 温 度 若 在 ５０℃ 持 续 ５ ｍｉｎ，酿酒酵母菌株 ９９％会死亡 。 ［13］ 本研究结果表明，该
８．０ 时，酿酒酵母菌的生长明显受到抑制 ；当培养基 初始 ｐＨ 值在 ４．０～６．０ 之间时， 酿酒酵母生长情况较好， 其中 ｐＨ 值为 ４．０ 时最适合该酵母菌生长。 详见图 ２。
ＯＤ 值
1．４ １．２ １．０ ０．８ ０．６ ０．４ ０．２ ０
６
１２
２０
２４
３６
培养时间 ／ｈ
图 ２ 不同 ｐＨ 值的培养基对酵母菌生长的影响
38 doi：10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.010
中国草食动物科学
酿酒酵母菌生长特性的研究
2016 年
刘龙海 1，李新圃 1，杨 峰 1，罗金印 1，张 哲 1，2，李宏胜 1 （ 1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室， 甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050；2.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）
1.4 酿酒酵母菌液浓度测定
本实验通过测定酵母菌培养液的 ＯＤ 值来估算酿酒 酵母菌的浓度。 对培养的酵母菌菌液进行 ５ 倍、１０ 倍、１５
倍、２０ 倍稀释，取合适浓度酿酒酵母菌菌液加入比色管， 以 无 菌 ＹＥＰＤ 液 体 培 养 基 作 空 白 对 照 ， 用 分 光 光 计 在 ４５０ ｎｍ 波长进行 ＯＤ 值测定，３ 次测定取平均值。
收稿日期：２０１６－ ０１－ ２１ 基 金 项 目 ：“ 十 二 五 ”国 家 科 技 支 撑 计 划（ ２０１２ＢＡＤ１２Ｂ０３） ；甘 肃 省 科 技 支 撑 计 划（ １４４ＮＫＣＡ２４０） ；甘肃省农业科技创新项目（ ＧＮＣＸ－２０１３－５９） ；中国农业科 学院奶牛疾病创新工程（ ＣＡＡＳ－ ＡＳＴＩＰ－ ２００４－ ＬＩＨＰＳ－ ０３） 作者简介：刘龙海（ １９９０－ ） ，男，硕士，主要从事奶牛乳房炎疫苗研究。 通讯作者：李宏胜（ １９６４－ ） ，男，研究员，博士，主要从事奶牛乳房炎免疫及 预 防 研究。
Liu Longhai，Li Xinpu，Li Hongsheng，et al （ Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province，Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Discovery，
高奶产量和乳脂含量 。 ［4-8］ 根据最新农业部 ２０１３ 年公布 的饲料添加剂品种目录，酿酒酵母菌可直接作为饲料的 活性添加剂，而酿酒酵母培养物、酿酒酵母提取物、酿酒 酵母细胞壁等列入饲料原料品类，这表明酿酒酵母类产 品在饲料产业中的比例将越来越大。
为提高酿酒酵母菌发酵的产量和效率， 研究人员对 酿酒酵母菌的生长特性进行了研究，结果表明，培养温 度、ｐＨ 值、水分含量、氧化应激、渗透压、产物浓度等因素 能影响酿酒酵母菌的生长特性 。 ［9-11］ 其 中 ，培 养 基 的 ｐＨ 值与培养温度是影响酿酒酵母生长最重要的因素之一， 它们可通过影响酿酒酵母菌内的生化反应进而影响酿 酒酵母菌的生长。
1.3 酿酒酵母菌活菌计数
本实验酿酒酵母菌计数方法采用稀释平板计数法。 对培养的酿酒酵母菌菌液进行 １０ 倍梯度稀释， 取 ３ 个 合适稀释浓度的菌液各 １００ μＬ，分别涂布至 ＹＥＰＤ 固体 培养基，置恒温培养箱中，２８ ℃培养 ４８ ｈ，每个稀释度做 ３ 个平行试验。 培养结束后，取出平板，观察菌落生长情 况，选取菌落数目在 ３０～３００ 之间的平板进行细菌计数， 计算得出酿酒酵母菌的活菌数量， 记录数据并取平均 值。
Ministry of Agriculture，Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Pharmaceutical Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050，China）
摘要：为探究温度和 pH 值对酿酒酵母菌生长特性的影响，采用单因素实验设计，检测了不同温度、
不同初始 pH 值对酿酒酵母菌生长的影响。 结果表明，培养基 pH 值和温度对酿酒酵母菌的生长具
有明显的影响，当 pH 值为 3.0 或者 8.0，温度为 20 ℃或高于 40 ℃时，酿酒酵母菌的生长明显受到
1.5 酿酒酵母菌的生长特性研究
１．５．１ 不同 ｐＨ 值的培养基对酿酒酵母菌生长特性的影 响 将配制好的 ＹＥＰＤ 液体培养基，分装于 ９ 个 １５０ ｍＬ 三角瓶，每瓶 ５０ ｍＬ，１１２ ℃、２０ ｍｉｎ 高压灭菌，放凉后用 无 菌 １ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 和 １ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ 调 整 每 瓶 培 养 基 ｐＨ 值分别为 ３．０、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０ 和 ８．０。
牛场采集的饲草饲料样本，由中国农业科学院兰州畜牧 与兽药研究所奶牛乳房炎课题组分离、鉴定和保存。 １．１．２ 培养基及试剂 ＹＥＰＤ 培养基购自北京吉美生物 技术有限公司；琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 菌种的活化
将冻存的酿酒酵母菌菌株接种至装有 ３０ ｍＬ ＹＥＰＤ 液体培养基的三角瓶中， 置 ２８ ℃恒温振荡培养箱，１２０ ｒ／ｍｉｎ 培养 ４８ ｈ。 镜检纯粹后接种到 ＹＰＤ 固体培养基，置 恒温培养箱，２８ ℃培养 ４８ ｈ，取出后 ４ ℃冰箱中保存。 实 验前，挑取单菌落接种至 ２ ｍＬ ＹＥＰＤ 液体培养基的试管 中，置 ２８ ℃恒温培养箱中培养 ４８ ｈ。
酿酒酵母菌是一种与人们日常生活关系最为密切的 酵母菌。 酿酒酵母菌不仅含有丰富的蛋白质、核酸、维生 素、微量元素等营养物质，而且部分酵母菌的培养液具 有杀菌或抑菌作用 。 ［1-3］ 研究发现，在奶牛饲料中添加活 性酿酒酵母菌可以改善奶牛食欲、促进瘤胃蠕动、增强 纤维消化能力、平衡瘤胃酸碱度、防止瘤胃酸中毒和提