高效降解羽毛角蛋白菌株的筛选与鉴定

龙宏燕，梁文英，陈风蔚，等．羊毛角蛋白降解菌的筛选鉴定及液体发酵条件优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０２１，４９（４）：２００－２０４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２１．０４．０３６羊毛角蛋白降解菌的筛选鉴定及液体发酵条件优化龙宏燕１，梁文英２，陈风蔚３，王睿勇１（１．南京大学生命科学学院，江苏南京２１００２３；２．南京大学金陵学院，江苏南京２１００８９；３．南京市淡水水产研究所，江苏南京２１００１７） 摘要：从长年堆积羊毛的土壤中筛选获得３株具有角蛋白降解功能的菌株，经形态观察和１６ＳｒＲＮＡ测序初步鉴定，并分别命名为链霉菌ＮＪＵ－０５、金黄杆菌ＮＪＵ－０７、地衣芽孢杆菌ＮＪＵ－１０。

同时，进行液体发酵工艺优化，得到ＮＪＵ－０５菌株实验室水平的最佳液体发酵条件：温度为４０℃，ｐＨ值为９．０，发酵周期为３ｄ；ＮＪＵ－０７菌株：温度为３５℃，ｐＨ值为９．０，发酵周期为４ｄ；ＮＪＵ－１０菌株：温度为３５℃，ｐＨ值为９．０，发酵周期为４ｄ。

关键词：羊毛角蛋白；液体发酵；工艺优化；降解菌；筛选鉴定 中图分类号：Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２１）０４－０２００－０５收稿日期：２０２０－０５－１４基金项目：国家自然科学基金（编号：３０５７１３５４）。

作者简介：龙宏燕（１９９５—），女，安徽淮南人，硕士研究生，主要从事应用微生物研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｏｎｇｈｏｎｇｙａｎ１９９５＠１６３．ｃｏｍ。

通信作者：王睿勇，博士，副教授，主要从事应用微生物研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｒｙ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。

近年来，随着养殖业的迅猛发展，和我国是革制大国的基本国情，会产生大量的羊毛、皮革加工废弃物。

有统计显示，我国每年平均产生角蛋白类废弃物的总量超过４００万ｔ［１］，这些废弃物由于难于加工且不易降解，大部分未得到合理利用。

这类废弃物大量堆积不仅会造成环境的严重污染，同时也是一种极大的资源浪费［２］。

农药降解微生物的筛选和鉴定随着农业生产的不断发展和进步，农药的使用逐渐成为了提高农作物产量和品质的重要手段。

然而，长期高强度使用农药也给生态环境和人类健康带来了一定的风险和威胁。

为了减少农药对环境和人体的危害，寻找一种安全、高效的降解方法已经成为了重要的研究方向之一。

而利用微生物进行农药降解成为了一种备受关注的解决途径，因为微生物可以通过吸附、降解、转化等方式将农药降解无害物质，从而实现环境和人健康的保护。

然而，微生物降解效率的高低，直接决定了它在农药降解过程中的应用价值。

因此，寻找适合的微生物进行农药降解，成为了重要的研究点之一。

第一步要做的事情是筛选。

为了寻找适合降解农药的微生物，首先需要从自然界中的土壤、水体等样本中开展微生物的筛选研究。

一般而言，选择样本时要尽量选取与目标农药污染草地有较强的关联性和相似地理位置的样本，以期能够找到更适合的菌种。

在筛选的过程中，应该注意到不同菌种在降解效率、降解速度、生长适应条件、细胞生命等方面存在较大差异。

因此，需要针对目标农药，制定更加具体的微生物鉴定方案，设计合理的实验方案促进筛选工作的开展。

接下来，就要进行种菌和鉴定。

在筛选出适合降解农药的微生物后，需要进行种菌工作，并发展良好的微生物种质资源。

在细菌鉴定过程中，可以通过以形态、生理生化、分子生物学等方法进行鉴定，以期更加准确地判定细菌种类和特征，进一步验证其对农药的降解能力和效率。

比如，针对目标农药的种类与形式不同，可能导致微生物对其降解效率与速度差异较大，因此在进行初步筛选工作的同时，就要进行微生物的鉴定和潜力评价。

最后，就需要量化评价。

针对筛选的适合降解农药的微生物进行量化评价与实验验证，是推动微生物农药降解向工业化、标准化方向的主要应用手段。

在量化评价的过程中，主要包括解析菌株对农药的降解效率、降解速度、降解产物和适应环境等方面的具体表现。

同时，建立科学合理的微生物降解评价标准，对于促进微生物降解的推广应用也有着重要的意义。

羽毛角蛋白降解的研究进展♦作者：彭俏丽张辉华*♦单位:佛山科学技术学院生命科学与工程学院摘要：羽毛是禽类表皮细胞衍生的角质化产物，因其富含角蛋白而得到人们的青睐。

由于角蛋白结构较为稳定、难以降解而不能得到充分利用，严重浪费蛋白质资源，还造成环境污染本文在总结对比角蛋白降解技术的基础上，对角蛋白酶产生菌、酶解机理以及角蛋白的应用进行了综述。

关键词：角蛋白；角蛋白酶；羽毛；降解[中图分类号]S816.4 [文献标识码]A[文章编号]1005-8613(2020)10-0043-04近年来，随着我国规模化养殖模式的推广，畜禽养殖业迎来高速发展，但与此同时也产生了大量的养殖废弃物，其中包含羽 毛、毛发、蹄等。

羽毛中富含角蛋 白，角蛋白是一种硬性蛋白，具 有稳定的结构，很难被直接利用。

数据显示，按照羽毛质量占活禽总质量的5%~7%进行计算,我国每年产生的羽和毛等角蛋白高达数百万吨。

大量的羽毛 的堆积不仅会造成严重的环境污染，还浪费大量的蛋白质资源。

因此，在生态环境要求以及我国蛋白质资源短缺的情形下，对羽毛角蛋白的开发利用具有十分重要的意义。

1羽毛角蛋白结构和性质角蛋白分为硬角蛋白和软角蛋白。

在两种不同类型的角蛋白结构中，硫的含量不同，使角蛋白具有更软或更硬的结构，并在更大程度上影响角蛋白材料的降解。

在动物的毛发、羽毛、鱗片、蹄、鼻、角、爪等结构中普遍存在一种具有很强抗性的硬角蛋白（Dudy ft ski 等，2012)，含硫量约占干重的5%;而人表皮中的软角蛋白含硫量约占干重的l%(Fellahi等，2016)。

角蛋白一级结构由19种a-氨基酸组成，其中氨基酸的组成及其分子结构决定了角蛋白具有不易降解的特性(Branfielli等，2010)。

不同来源的角蛋白，其组成氨基酸的种类和含量也会有所不同。

角蛋白二级结构由a-螺旋或/3-折叠组成。

根据二级结构的差异，可将角蛋白分为a-角蛋白和0-角蛋白。

其中，a-角蛋白的伸缩性能较好,人和动物毛发中的角蛋白多属于此类；13-角蛋白的抗张性能较好，主要存在于动物的蹄、角及鸟类羽毛中(Sivakumar等，2015 )〇角蛋曰内部由于存在分子间的疏水力、氢键、盐键，以及不同肽链间由胱氨酸残基所产生的二硫键相互高度交联形成的三维稳定结构，使得角蛋白不溶于水且一般情况下难以被水解。

食物垃圾中具备高效降解功能菌株的筛选与鉴定分析【摘要】目的：探讨食物垃圾中具备高效降解功能菌株的筛选与鉴定。

方法：收集食堂、大排挡周边采集土壤3份样品，进行菌株分离与培养，然后进行光学显微镜与电子显微镜判断。

结果与结论：获得单菌落32株，经过定性和定量的方法进行复筛，最终得到食物油脂高效降解分解菌3株，初步鉴定分别为毛霉属、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的一个种。

【关键词】食物垃圾；高效降解功能菌株；毛霉；蜡状芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌食物垃圾是人们在生活消费过程中形成的生活废物，极易腐烂变质，散发恶臭，传播细菌和病毒[1]。

一家一户的食物垃圾数量虽不多，但千家万户汇集的总量却相当庞大，因其来源分散不易收集，难以进行堆肥或饲料加工等资源化利用，对垃圾填埋或焚烧处置带来诸多问题[2]。

前人很多研究对城市食物垃圾的液态部分以及固态部分进行分别处理研究，利用微生物技术，对食物垃圾资源化利用进行了理论和实验研究，探索利用食物垃圾制备蛋白饲料的技术路线[3]。

本研究为此具体探讨了食物垃圾中具备高效降解功能菌株的筛选与鉴定。

现报告如下。

1 材料与方法1.1 样品与仪器食物垃圾分离样品：从某某大学食堂下水道采得污泥以及周围的土壤，从壕沟及大排挡排污处采得土样，共计3份样品。

实验仪器：AY220型电子天平、50B恒温冷冻摇床XS-18型光学显微镜、FEGUV755B型扫描电子显微镜。

1.2 分离方法每个样品各取5g，分别加入含有45ml无菌水和无菌玻璃珠的150ml三角瓶内，置于摇床上，200 r/min转速充分震荡10min，然后取5ml稀释加入35ml富集培养基中，并在40℃，200 r/min，pH 7.0条件下培养。

以后每天观察，如果发现油脂降解得好，就补加少量豆油。

培养24h至48h后挑取不同类型的单个菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上连续纯化，从而得到纯培养物，4℃保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面。

将分离得到的菌株点接到油脂初筛培养基平板上，置于45℃恒温箱中培养，24h后，用游标卡尺测量菌落周围晕圈直径，并以此判断待测菌株对油脂的分解能力。

环境科学中的降解菌筛选技术随着人类社会的发展，环境污染问题也日趋严重。

传统的污染治理手段难以完全消除污染物，因此新的治理技术和手段在不断探索中得以发展。

其中，利用微生物去除污染物已经成为环境治理的重要手段之一。

而在利用微生物降解污染物时，采集高效的降解菌则是关键的一步。

本文将探讨目前环境科学中的降解菌筛选技术。

降解菌筛选方法传统的降解菌筛选方法主要是基于对环境样品的分离鉴定。

这种方法的优点是能够从环境中筛选出适应该环境的菌株，具有较高的筛选成功率。

但同时也存在着诸如分离时间长、筛选效率低、难以分离纯净的菌体等问题。

为了克服传统筛选方法的局限性，近年来出现了多种新开发的筛选方法。

其中主要包括：基于红外特异光谱图像分析的筛选法、利用高通量菌落筛选技术的方法、基于PCR-DGGE和16S rRNA基因测序的筛选技术等。

基于红外光谱图像分析的筛选法是利用红外光谱图像分析降解菌的表达规律；利用高通量菌落筛选技术的方法则是将样品分为数千个小样品块，在不同菌落上筛选高效的菌株；基于PCR-DGGE和16S rRNA基因测序的筛选技术则是在样品中筛选出可能存在的降解菌，然后利用基因测序确认其种类。

使用筛选技术的优势与传统的降解菌鉴定方法相比，使用筛选技术降解菌的优势在于提高了筛选的准确性和效率。

使用筛选技术降解菌，可以快速、准确地研究、找出适应不同污染环境的微生物，大大缩短了研究时间和成本。

此外，筛选出的降解菌株能够高效利用污染物，不会对周边环境造成二次污染。

同时，在降低环境污染的同时，也可为相关产业开发提供先进技术的支持。

开发筛选技术的挑战尽管近年来筛选技术的研究不断发展，但在实际应用中仍存在着不少挑战。

第一，针对不同环境的降解菌筛选可能存在适应性问题。

不同于传统鉴定菌株，筛选技术得到的结果只能够尽可能地达到样品源污染物的相关菌群，且不能全部涵盖。

此外，测试的效率和成本也是瓶颈。

筛选技术必须具备高效、快捷的筛选能力，同时成本也必须低廉。

高效棉酚降解菌株的筛选鉴定及其差异蛋白质组学研究的开题报告一、研究背景和意义随着现代化的发展和大规模化生产的不断增加，棉纺织工业日益兴旺。

但是，棉纺织工业在生产过程中也会产生大量的棉酚废水，对环境造成了严重的污染。

因此，开发一种高效降解棉酚的菌株，对于保护环境和促进棉纺织工业的可持续发展具有重要意义。

二、研究内容和方法1. 筛选鉴定棉酚降解菌株：采用天然水样、腐烂的植物和土壤等样品作为菌源，用浸泡法对其进行筛选。

然后，对筛选出来的菌株进行鉴定，包括形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列等方面的分析。

2. 差异蛋白质组学研究：采用二维凝胶电泳技术分离棉酚菌株发酵前后的细胞蛋白，并进行比较分析。

然后，应用质谱等技术对差异蛋白进行鉴定和功能分析。

三、预期成果和意义1. 筛选出一株高效降解棉酚的菌株，通过进一步试验验证其降解效率和适应性。

2. 发现差异蛋白及其功能，研究棉酚降解菌株的分子特征和代谢途径，为深入研究其降解机理提供有力支持。

3. 对于环保和棉纺织工业的可持续发展做出贡献，为开发更高效、环保的棉纺织生产模式提供科学依据。

四、研究难点与解决方法1. 难点：筛选出高效降解棉酚的菌株。

解决方法：采用浸泡法和多种菌源进行筛选，增加菌株的多样性；结合生理生化特性和16S rDNA序列鉴定，筛选出具有降解潜力的菌株。

2. 难点：对差异蛋白进行准确鉴定。

解决方法：采用二维凝胶电泳技术分离蛋白，结合多种鉴定技术如MALDI-TOF/TOF质谱鉴定蛋白质，提高鉴定准确率。

五、研究进度安排初步研究棉酚降解菌株的分离、初筛和鉴定已完成，接下来进行菌株的深层次筛选，以降解效率为主要指标进行评价。

差异蛋白组学实验已开始，计划在6个月内完成实验和数据分析。

预计12个月内完成全部研究工作，完成论文撰写并进行答辩。

Vol.24　No.3May 2008科技通报BULL ETIN OF SCIENCE AND TECHNOLO GY第24卷第3期2008年5月羽毛的生物降解及其酶学性质的研究傅　伟,阮　晖,刘　婧,王金玲,陈启和,何国庆3(浙江大学食品科学与营养系,杭州310029) 收稿日期:2007-04-18基金项目:国家自然科学基金资助(20776130)作者简介:傅伟(1982-),硕士研究生,主要从事微生物发酵的研究。

3通讯作者:何国庆(1957-),教授,博士生导师,主要从事食品微生物与发酵工程,食品生物技术及相关的研究。

摘要:羽毛角蛋白是一种环境污染有机废弃物,通过微生物对角蛋的进行降解为合理利用,可以使它成为丰富的饲料蛋白来源。

适当的降解方法对于羽毛资源的转化有着重要作用。

采用正交设计优化地衣芽孢杆菌细胞转化羽毛的条件,得出角蛋白酶的合成和羽毛的分解指标,三因子最合适配比为:液料比20:1,反应p H 715,BC 细胞加量015克,40℃下120r/min 处理72h ,其中细胞加量对羽毛分解有关键影响。

粗酶液最适温度在37℃,在35℃～40℃有很好的热稳定性。

不同p H 下酶活变化明显,在p H 5-8范围内比较稳定。

关键词:羽毛角蛋白;地衣芽孢杆菌;角蛋白酶;生物转化条件;酶学特性中图分类号:Q502文献标识码:A文章编号:100127119(2008)0320320205R esearch on Biodegradation of Poultry Feather andIts Enzymatic CharacterizationFU W ei ,R UA N H ui ,L I U J i ng ,W A N G J i nli n g ,Chen Qi he ,H E Guoqi n g3Abstract :Feather keratin is an organic environment 2polluting rubbish ,although it is the abundance of resource on animal stuff protein ,which utilized by microorganisms that could have soluble keratin activity.The result of the ex 2periment showed that an optimal degradation method was very important for feather biotransformation.Experimen 2tal results demonstrated that the optimal conditions were as follows :liquid to substrate 20:1,biotransformation p H 715,B acill us licheni f ormis cell mass 015g ,degradation temperature 40℃and 120r/min rotation speed ,72h.A 2mong these ,the bacterial cell was the most important.Experiment data showed that the optimal reaction tempera 2ture of crude enzyme was 37℃.This enzyme was very stable when the temperature about 35℃～40℃,and was sta 2ble f rom p H 5to p H 8.K ey w ords :feather keratin ;Bacillus licheniformis ;keratinase ;biotransformation condition ;enzyme characterization 角蛋白存广泛在于如动物毛发、羽毛、蹄、角等组织,是一种坚韧的不溶性蛋白,自然界中的含量丰富[1,2]。

环境污染物降解菌的筛选及其应用研究随着现代工业的发展，环境污染成为一个日益严重的问题。

这些污染物对人类的健康和环境的生态稳定造成了极大的威胁。

因此，降解环境污染物成为了一个紧迫的任务，其中环境污染物降解菌的筛选和应用研究就成为了重要的研究内容。

本文将对环境污染物降解菌的筛选及其应用研究进行探讨。

一、环境污染物降解菌的筛选环境污染物降解菌是一类具有特殊代谢功能的微生物，可以通过吸收、转化、分解、利用污染物质来减低或消除环境中的有害物质。

这些菌株广泛存在于自然界中，如土壤、水体和沉积物中等，有些甚至可以从污染源中分离出来。

由于不同的环境污染物的成分和性质有很大的差异，因此不同的菌株对不同的污染物物质有不同的反应。

因此，对于寻找适合的菌株进行分解就成为了一个挑战。

环境污染物降解菌的筛选主要包括两个方面，一是从自然界中筛选具有降解能力的菌株，二是通过基因工程技术筛选出具有特定降解功能的菌株。

从自然界中寻找环境污染物降解菌的方法主要有三种。

一是通过样品分离的方法，即通过从污染土壤、废水或纯化有机物中分离到具有降解能力的微生物。

二是直接从污染源中获取菌株，如从工厂废水中分离、从油窑或石油泄漏现场中分离。

三是通过对自然界中微生物的特性进行鉴定，如首先寻找具有易生长、菌落明显、降解速率快的菌株，再对其进行鉴定，筛选出具有特殊降解能力的菌株。

基因工程技术是一种快速而高效的筛选途径，可以通过获得污染物分解途径中的降解酶基因、浓度可感应表达系统或高效表达系统等，将其转移到其他微生物中，以构建特定降解菌株。

这种筛选方法最大的优点是可以针对特定的污染物进行定制，从而出现对多污染物的同时降解的菌株。

二、环境污染物降解菌的应用研究环境污染物降解菌的应用研究主要包括两个方面，一是菌株应用的基础研究，二是菌株应用的实际情况。

基础研究主要包括对降解菌株的鉴定和评估、降解途径的研究、降解产物的分析及对菌株生长环境的优化等。

这些研究对环境污染物治理及其监测有很大的实际意义。