高效石油降解菌的筛选及其降解特性

第 ２ 卷 第 ５期 １
２００８年 １０月
污
染
防
治
技
术
Ｖｏ ． Ｉ２１． ． Ｎｏ ５
０ｃ ．２０ ０ ８ ｔ．
ＰＯＬＬ ＵＴ１ ０Ｎ ＣＯＮＴＲ０Ｌ ＴＥＣＨ ＮＯＬＯＧＹ
石 油 降 解 茵 的 筛 选 及 降解 性 能 研 究
李 海花 ， 单爱 琴 ， 周海 霞
ｏｌｄ ｇ ａ ａｉｎ ｒ ｔ． Ｔｗｉ８ ａ ｎｈｂｉ ｒ ｆｅ ｔ ｎ ｏｌｄ ｇ ａ ａｉｎ． ｉ ｅ ｒ ｄ ｔｏ ａｅ ｎ ０ ｈ ｄ ｉ ｉ ｔ ｙ ｅｆ ｃｓｏ ｉ ｅ ｒ ｄ ｔ ｏ ｏ Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｔｏｅ ｍ ； ｉ ｄ ｇ ａ ｔ ｎ；ｄ ｇ ａ ｉ ｇ ｂ ｃ ｅｉ ｐｅｒｌ ｕ ｂ ｏ ｅ ｒｄａｉ ｏ ｅ ｒ ｄ ｎ ａ ｔｒａ；ｄ ｇ ａ ａｉ ｎ ｒ ｔ ｅ ｒ ｄ ｔｏ ａｅ
处理 石油污 染作 了初探 。
５ｇ 琼脂 ２ ， ， ０ ｇ 蒸馏 水 １ ０ Ｌ，Ｈ为绘 学院 ，江 苏 徐 州 ２ １０ ） ２ ０ ８
摘 要 ： 石 油 污 染 的 土壤 中分 离驯 化 ， 到 特 征 明显 的石 油 降 解 菌 ， 究 了 不 同 时 间 、 油 浓 度 、 种 量 、Ｈ值 、 质 从 得 研 石 接 ｐ 基
及添加物等条件对 降解菌 降解石油 的影响。结果 表明 ： 在实验条件下 ， 降解菌接种量越 多 ， 降解 效果越好 ； 石油降解效率随
ｐ Ｈ ｖ ｌ ｅ，ｇ ｒ ｉｕ ｅ ａ ｄ Ｓ ｎ． Ｔｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｓ ｏ ｄ ｈａ ｄ ｒ ｔｅ ｅ ｔｃ ｎ ｔｏ ｓ，ｔ ｅ ａｕ ａ ｎｔ ｒ ｎ Ｏ ｏ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｔ ｔｕｎ ｅ ｈ ｔｓ ｏ ｄｉｉｎ ｈ ｍｏｅ ｄ ｓ ｓ ｗｅｅ ｄ ｅ ｒ ｏ ｅ ｒ ａ ｄ ｄ，ｔ ｅ ｈ ｍｏｅ ｅｆｃｅ ｔ ｒ ｆｉｉｎ

两株石油降解菌的筛选及其生长特性DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.02.016土壤是人类赖以生存的自然基础和重要资源，近年来，随着社会经济发展对石油产品需求量增加，大量的石油及其加工品在勘探、开采、运输、加工及储存的过程中进入土壤，造成土壤的石油污染日趋严重，已成为世界性的环境问题[1，2]。

石油物理化学性质特殊，进入土壤后残留时间长，在自然条件下难以降解，给受污染土壤带来一系列的危害：石油黏性强，影响土壤的通透性，使土壤盐碱化、沥青化和板结化，破坏土壤结构和功能，在长期累积过程还会导致土壤中碳氮比和碳磷比失调，引起土壤微生物群落变化，破坏土壤微生物区系，影响植物生长；石油中所含的多环芳烃具有致癌、致突变、致畸变等作用，它们能通过食物链在动植物体内逐级富集，危及人类健康和生态安全[3，4]。

鉴于以上原因，修复和治理污染土壤已经成为迫切需要研究解决的问题。

目前石油污染土壤的修复方法主要有物理方法、化学方法和生物方法，其中微生物处理技术具有经济、有效和环境友好等特点，是目前修复石油污染土壤优先考虑的技术[5，6]。

微生物修复技术是微生物通过代谢作用将石油污染物转化为稳定、无毒的以二氧化碳、水和无机物为主的降解产物。

石油的降解程度和速度取决于微生物特性、污染物的性质和环境因素，而具有强降解能力的石油降解菌是决定生物修复效率的关键因素。

因此，需要有针对性地筛选适合本地区石油污染土壤的土著高效降解菌。

新疆是中国石油主产区，存在大面积石油污染土壤亟待修复[7，8]。

基于此，本研究从新疆石油污染土壤中筛选出2株高效石油降解菌，通过形态和生理生化试验对其进行了初步鉴定，并初步研究该菌的生长特性和培养条件，以期为新疆石油污染土壤的微生物修复提供试验基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土壤和石油样品分离菌种土壤采自新疆油田区污染程度不同的位置，采样时取地表10 cm污染土壤1.0 kg，去除杂物，装入密封袋，于4 ℃冰箱保存。

（2）pH值对菌株降解效率的影响：在pH值为7.0时，菌株X的降解效率最高， 达到60%以上。当pH值偏离7.0时，其降解效率明显下降。
（3）盐度对菌株降解效率的影响：在低盐度条件下，菌株X的降解效率较高。 随着盐度的增加，其降解效率逐渐降低。当盐度超过5%时，其降解效率显著下降。
（4）产物分析：利用GC-MS等技术，我们对菌株X降解石油烃的产物进行了 分析。结果显示，菌株X能够将石油烃主要降解为脂肪酸、酚类化合物等中间产 物。这些中间产物在进一步降解过程中转化为二氧化碳和水，从而实现石油烃的 生物修复。
2、筛选流程：首先，采集油污土壤和石油废水样品，进行富集培养；其次， 通过初筛和复筛，获得具有较强石油降解能力的菌株；最后，通过形态学和分子 生物学鉴定，确定菌株种类。
3、鉴定步骤：将筛选得到的菌株进行16S rDNA分子鉴定，利用细菌分类学 软件进行比对分析，最终确定菌株的种属。
4、石油降解特性分析：采用液体培养法测定菌株的石油降解能力，通过测 定不同时间点石油烃类物质的含量，计算菌株的降解速率和降解效率。
1、菌株筛选
从石油烃污染地区采集土壤样品，采用富集培养法，经过多步筛选，获得具 同温度、pH值、盐度等条件下，对菌株降解石油烃的能力进行测定。通 过改变环境因素，观察其对菌株降解效率的影响。同时，利用气相色谱-质谱联 用（GC-MS）等技术，对菌株降解的产物进行分析。
参考内容
一、引言
石油烃是石油和天然气的主要成分，它们在自然环境中的存在和降解对全球 碳循环和环境生态有着重要影响。厌氧降解菌在石油烃的降解过程中扮演着关键 角色。本次演示旨在筛选出具有高效石油烃厌氧降解能力的菌株，并对其降解特 性进行研究，以期为石油烃污染的生物修复提供理论依据。
二、材料与方法

土壤中高效石油降解菌的筛选及其降解特征的研究林标声;陈雪英;江胜滔;林跃鑫【期刊名称】《福建师大福清分校学报》【年(卷),期】2010(000)002【摘要】从受石油产品污染土壤中筛选出5株石油降解菌,并通过生理生化实验对其进行了初步鉴定.石油降解能力的测定结果表明,其中KF-2、KF-4两株菌均为微球菌属(Microrococcus sp.),石油降解能力较强,其单菌落接种20天后石油降解率分别可以达到76.21%、74.82%.在对这两株菌的降解特征的进一步探究中发现:KF-2菌株在NH4NO3作为氮源的条件下石油降解率较高;而KF-4在(NH4)2SO4作为氮源的条件下石油降解率较高.环境pH为7时,KF-2、KF-4的石油降解率都最高.混合菌的试验表明,KF-2、KF-4混合菌的降解效果明显好于各单菌株接种降解效果.【总页数】6页(P11-16)【作者】林标声;陈雪英;江胜滔;林跃鑫【作者单位】龙岩学院生命科学学院,福建龙岩,364012;龙岩学院生命科学学院,福建龙岩,364012;龙岩学院生命科学学院,福建龙岩,364012;龙岩学院生命科学学院,福建龙岩,364012;福建师范大学生命科学学院,福建福州,350108【正文语种】中文【中图分类】Q93-3【相关文献】1.石油污染土壤中降解菌的分离鉴定及降解基因筛选 [J], 秦薇;梁玉婷;刘勇俊;刘雨佳;赵远2.石油污染土壤中降解菌的分离鉴定及降解基因筛选 [J], 秦薇;梁玉婷;刘勇俊;刘雨佳;赵远;3.石油污染土壤中石油降解菌的筛选及降解特性研究 [J], 汤小萌;马超;熊元林4.石油污染土壤中苯降解菌的筛选及降解特性研究 [J], 姚治华;王红旗;刘敬奇;张小啸5.高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究 [J], 徐金兰;黄廷林;唐智新;肖洲强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2020年02月Bi 、Ni 、Fe 、Mn 、Ca 、Mg 、Al 、Cu 、Pt 、Pd 标准溶液0、0.50、1.00、5.00、10.00ml 于100ml 容量瓶中，分别加入10ml 王水，用去离子水定容至刻度摇匀以备用；此系列混合标准溶液为0、0.5、1、5、10µg/ml （个别含量高的元素可准备为50µg/ml 的高标）。

（3）样品的测定。

将上述保留的分金溶液及洗液蒸发至近干，用王水加热溶解，冷至室温定容至刻度线，混匀静置待测。

采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES ）在相应的波长下测定铋、铅、铜、铁、砷、蹄、镍、镉、猛、钙、镁、铝、铂、钯的浓度，仪器需优化消除干扰以获得最大的灵敏度，使谱线强度和浓度成线性关系。

将所有元素的测定值减去空白值相加来计算分金溶液和洗液中的总杂质含量。

3结果3.1金银合粒中存在的杂质元素根据铜精矿元素情况，其中主要金属元素含有铜、铁、钙、镁、铝、铋、铅、砷、蹄、镍、镉、猛、铂、钯等14种元素，通过火试金分离富集得到的金银合粒除去了大多数杂质元素，其主要成分为金银，其余杂质成分含有少量的铅、铋、钙，部分样品含有少量的铂、钯[1]。

本文列举了几种有代表性的铜精矿分析各元素含量可知6类样品金银合粒中铜、铁、砷、蹄、镍、锰、镉、镁、铝的含量均＜0.2ug,其含量基本忽略不计，而所有铜精矿金银合粒中均含有铅、铋、钙这三种元素，含量随品位高低有波动，有2类铜精矿金银合粒中测出少量的铂、钯。

3.2方法精密度和样品回收率试验金银合粒中存在的杂质元素主要是铅、铋、钙、铂、钯，选择铜精矿样品，经火试金富集、分金酸溶解后按所选仪器最佳工作条件测定，考察方法的精密度和样品加标回收率（n=8）如见表2。

表2部分元素精密度和加标回收率元素Pb Bi Ca平均值/ug 30.2063.253.75RSD/%3.582.695.25加入量/ug 20.0050.003.00回收总量/ug49.90110.906.90回收率%99.40%97.92%102.22%3.3杂质元素对银品位影响准确测定各类铜精矿金银合粒中的杂质元素总含量，分析换算成品位的影响情况，通过统计数据得知大部分铜精矿金银合粒中杂质品位占比在0.5~4.5%，随着银品位升高杂质占比减少。

表 5 溶解氧与转速的关系( 30 e )
转速( r/ min) 0 60 100 140 180 220 260 溶解 氧( mg/ L) 0. 65 3. 72 5. 10 5. 71 6. 29 7. 11 7. 23
4 三相流化床处理含原油废水
三相流化床采用体积质量> 1 的细小惰性颗粒 活性炭作悬浮填料, 采用体积质量< 1 的树脂球作
漂浮填料, 再接种高效降解原油菌, 使其生长于这些 载体表面形成生物膜, 通过曝气使废水自下向上流 动, 使载体处于流化状态, 其上附着的生物膜可与废 水充分接触。在温度为 30 e 、pH 值为 6. 5、停留时 间为 2~ 3 h、流量为 2~ 3 L / h 条件下处理含油废 水, 运行稳定后 2 h 取样分析 1 次, 处理结果见表 6。
膏 ) 蛋白胨培养基, 培养后离心分离获得菌泥, 将菌 泥按相同比例混合后投入含原油废水中, 采用摇动 培养, 考察 pH 值、溶解氧、温度等因素对处理效果 的影响。
测定 pH 值用玻璃电极法, 测定溶解氧用膜电 极法, 测定油含量用紫外分光光度法[ 2] 。 312 结果与讨论
¹ pH 值 当废水油 含量为 35. 42 mg/ L、处 理温度 为 30 e 、摇床转速为 200 r/ min、投菌量为 5 g ( 湿重) / L 时, 在不同 pH 值下处理 12 h 及 24 h 后发现, pH 值 为 5. 5~ 7. 0 时能有效地降解废水中的原油, 且随着 处理时间的延长, 除油率增大。当处理时间为 12 h 时除油率为 42% ~ 57% ; 当处理时间为 24 h 时除油 率达 70% ~ 78% 。当 pH < 5. 0 或> 9. 0 时除油率 迅速降低, 这是因为随着 pH 值的变化, 酶分子上的

进行 研究 ， 研究 结果 可 为 石 油 污染 土壤 生 物 修 复 提 供一 定 的指导 意义 。
无机 盐培养 基 ： Ｎ Ｈ４ Ｎ Ｏ ３ ２ ｇ ， Ｋ ２ Ｈ Ｐ Ｏ ４ １ ． ５ ｇ ， Ｋ Ｈ ２ Ｐ Ｏ ２ ． ５ ｇ ， Ｍｇ Ｓ Ｏ ４・ ７ Ｈ ２ Ｏ ０ ． １ ｇ ， 无水 Ｃ ａ Ｃ １ ２ ０ ． ０ １ ｇ ， Ｎ ａ ２ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ・２ Ｈ ２ Ｏ ０ ． ０ ２ ｇ ， 蒸馏水 １ ０ ０ ０ ｍＬ ， ｐ Ｈ 为７ ． ３ 。
重点实验室开放基金（ ２ ０ １ ４ Ｇ １ ５ ０ ２ ０ ３ １ ） 资 助
油醚 溶解后 ， 经０ ． ２ ２ ｍ 无 菌滤 器 加至 固体平 板 表 面并使 其 均匀分 散 。 牛 肉膏蛋 白胨 培养基 ： 牛 肉膏 ５ ｇ ， 蛋 白胨 １ ０ ｇ ，
别为７ ４ ． ２ ４ ％、 ７ １ ． ６ ６ ％和 ８ ０ ． ２ ９ ％。
关键词 石油降解菌
筛选
鉴定
特性研 究
中图法 分类号
Ｘ１ ７ ２
文献标志码
Ａ
石 油素 有 “ 工 业 的血 液 ” 之称 ， 在现 代 工业 中拥 有 举足 轻重 的地 位 ， 但 其 也会 带 来 众 多 环境 污 染 问 题 。由于技 术缺 陷和 管理 的不完 善 ， 在 石油 运输 、 开 采 以及 提炼 的过 程 中 ， 不 可避 免 地 会 对周 围环 境 产
⑥
２ ０ １ ６ Ｓ ｃ ｉ ． Ｔ ｅ ｃ ｈ ． Ｅ ｎ ｇ ｒ ｇ ．
环境科 学、 安 全 科 学
土壤 石油高效降解菌的筛选 、 鉴定 及 其 特 性 研 究
张 斌 朱 雷 郭 超 ， 刘 小英

原油降解菌JL21的筛选与降解性能分析作者：宫勋来源：《石油知识》 2017年第2期摘要：菌株JL21与Gordonia amicalis（序列号：KM113029）菌亲缘关系最近，同源性达99%，与构建系统发育树的结果一致。

因此，菌株JL21在分类学地位上初步确定为友善戈登氏菌Gordonia amicalis JL21。

随着2015年新环保法的公布，石油污染的有效处理已经成为国内外研究的重中之重。

微生物处理技术作为既经济高效又环保的方法，受到国内外研究人员的青睐。

本文着重探讨了石油降解菌的筛选与降解性能的测定。

关键词：原油；降解菌；表面活性剂1 实验材料和方法1.1 采样地点及原油来源分离、筛选、降解实验所用的原油及土壤样品均来自中国石油天然气股份有限公司吉林油田分公司。

1.2 培养基无机盐培养基（MSM）：Na2HPO4·2H2O 8.5 g、KH2PO4 3.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2 14.7 mg、CuSO4 0.4 mg、KI 1.0 mg、MnSO4·H2O4.0 mg、ZnSO4·7H2O 4.0 mg、H3BO3 5.0 mg、Na2MoO4·2H2O 1.6 mg、FeCl3·6H2O 2.0 mg，蒸馏水1 L。

pH7.0-7.2、121 ℃灭菌20 min。

原油降解培养基：在MSM培养基中添加0.5%的灭菌原油。

油平板：将原油溶于石油醚（原油终浓度为10%）中，滤纸剪成直径85 mm，置90 mm培养皿中，加2 mL 10%原油溶液，待石油醚挥发后，121℃高压蒸汽灭菌20 min，取出烘干备用。

无机盐培养基灭菌后倾倒平板，将滤纸紧贴在MSM平板上后即成油平板。

富集培养基：蛋白胨 10 g、牛肉膏 5 g、NaCl 5 g、蒸馏水 1 L，pH 7. 0.血液琼脂培养基：脱纤维绵羊血 50 ml、血液营养琼脂45 g、去离子水 1L。

１ ２ ３ 降解反 应体 系 ．． 为研究 原 油降解 菌在 Ｂ ＡＣ中降解 原 油 的效果 ，
设 置平 行对 照 实验 ， 实验设 计 见表 ２ 。
表 ２ 平 行 对 照 实验 组
Ｔ ａ ｌ Ｐａ ａ ｌｌｃ ｔ ｏ ｒ ｂｅ２ ｒ ｌｅ ｏｎ ｒ ｌｇ ｏｕｐ
分离 培养 基 ： 机 盐 培 养 基 １０ ０ ｍＩ， 水 原 无 ０ 脱 油 ３ｇ 琼脂 １ 。高 压蒸 汽灭 菌后 ， ， ８ｇ 制成平 板 备用 。 保存 培养 基 ：牛 肉膏 １ｇ 蛋 白胨 １ ， Ｃ ， ０ ｇ Ｎａ １ ５
度为 １ ０ｍｇ ｍＬ的原油 溶液 备用 。 ０ ／ １ １ ２ 原油 降解 菌 的驯化 和分离 ． ．
无 机 盐 培 养 基 ： ａ １１ ， １０ ５ ， Ｎ Ｃ ０ ｇ ＮＨ Ｃ ． ０ ｇ
ＫＨ２ ＰＯ４ ．５ ｇ， Ｈ ＰＯ４ ．０ ０ ０ Ｋ２ １ ｇ， ｇ Ｍ ＳＯ４ ．５ ｇ， ０ ０
法 不能 满 足达标 处 理 的要 求 。而且 随着 水 资源 的短
缺， 对含 油废 水 的排 水标 准不 断提 高 ， 以期 能 达 到 回 用 的 目的 。生物 活性 炭 （ ＡＣ 技 术具 有 活性 炭 吸 附 Ｂ ） 和微生 物 降解 双 重作 用 ， 能有 效 去 除水 中有 毒 有 害 物 质 ， 括一 些其 他 方法难 以去除 的 物质 ， 废 水 回 包 是 用 的一 个重 要方 法 。李伟 光 等［ 和李 安 婕等 ［ 采 用 ８ ３ ｇ Ｂ ＡＣ技术 处 理含 油废 水 ， 理效 果显 著 。 处
染 ， 至还 有 可 能 因为 聚 结 的油 品燃 烧 而产 生 安 全 甚 问题 ［ ］ ５ 。鉴 于含 油 废 水 的 污 染 性 ， 国规 定 含 油 我 废 水 最 高 允许 排 放 质 量 浓 度 为 １ ／ 因此 ， ０ｍｇ Ｌ０ 对 石 油 和石 化 等 行 业 产 生 的 含 油 废 水 进 行 有 效 处 理

石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性石油是一种重要的能源资源，但在石油的采运、储运、加工和使用过程中，往往会发生石油泄漏和溢出等事故，导致严重的石油污染问题。

石油污染土壤是指土壤中存在一定浓度的石油物质，这些物质会对土壤中的微生物群体和生态系统造成影响。

因此，对石油污染土中的微生物进行分离鉴定及降解特性研究，对于解决石油污染问题具有重要意义。

本文通过对石油污染土中的微生物进行分离鉴定及降解特性研究，探讨石油污染土的生物修复技术，为石油污染问题的治理提供理论依据。

在石油污染土中，常见的微生物包括细菌、真菌、放线菌和蓝藻等。

根据土壤中细菌和真菌在营养需求上的差异，可以采用不同的富集培养基对其进行分离培养。

1. 细菌的分离鉴定细菌在石油污染土中是主要的降解菌，通过对细菌菌株的分离鉴定能够确定污染土中的细菌种群。

首先，可采取Dilution Plate法将不同稀释程度的土样涂布于富集培养基表面，经过一段时间后，从菌落形态及色素等方面进行初步的鉴定。

然后，可通过菌落PCR和16S rRNA基因测序技术进一步鉴定和分类。

石油污染土微生物的降解能力和降解途径，是研究石油污染土生物修复技术的基础。

根据微生物降解路径的不同，可以将石油污染物降解成不同的产物，如二氧化碳、水、甲烷、醛、酮等。

1. 细菌降解特性细菌在石油污染土中是主要的降解菌。

其中，硫氧化细菌能够利用污染土中的硫化物对石油进行降解；芳香族细菌能够通过羧化、水解等途径将石油中的芳香族化合物降解成较小的芳香族化合物。

同时，细菌在降解过程中会产生一些代谢产物，如微量元素和氨氮等，有些可以促进污染土的生化过程，有些则会对土壤环境产生不利影响。

真菌在石油污染土中也有重要的降解作用。

真菌能够分泌多种外生酶，如过氧化物酶、脱氢酶等，对石油中的烷烃和芳香族化合物进行降解。

同时，真菌具有很强的氧气吸收能力，可以加速石油中挥发性有机物的挥发，从而实现石油的清除。

三、生物修复技术在石油污染土治理中的应用生物修复技术是指利用生物学机制将有害化合物转化为无害物质的一种环境修复技术。

!"#$%&'2020,Chemistry&Bioengineeringdoi：10.3969/j.issn.1672—5425.2020.12.013段潍超，杨泽群，刘其友.石油A高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化化学与生物工程，2020,37(12):5558.DUAN W C,YANG Z Q,LIU Q Y.Screening and compounding of high efficient petroleum hydrocarbon-degrading bacteria and opti­mization in degradation conditions'].Chemistry W Bioengineering,2020,37(12)：55-58.石油怪高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化段潍超杨泽群2,刘其友2(1.青岛欧赛斯环境与安全技术有限责任公司，山东青岛266555；2.中国石油大学(华东)，山东青岛266555)摘要：基于原油组成选取模式物，从实验室保存的石油A降解菌株(S1、S2、S3、S4、S5、S6"中筛选各模式物的高效降解菌株，并对高效降解菌株的复配进行优化，通过正交实验确定复配菌群的最优降解条件。

结果表明：菌株S2和S5对单环芳A(甲苯)的降解效果最好，菌株S1和S6对多环芳A(菲)的降解效果最好，菌株S4对长链烷A(石蜡)的降解效果最好；将S1、S2、S4复配得到的复配菌群对原油的降解效果最好，其最优降解条件为:pH值7、底物浓度0.4g・L1、氮磷比7:1、接种量1mL、温度30b，各因素对原油降解率的影响大小为：pH值％温度〉底物浓度％接种量〉氮磷比&关键词：石油A降解菌；筛选；复配菌群；正交实验；降解条件中图分类号：X172文献标识码:A文章编号：16725425(2020) 1205504ScreeningandCompoundingofHighE f icientPetroleum Hydrocarbon-DegradingBacteriaandOptimizationinDegradationConditionsDUAN Weichao1,YANG Zequn2,LIU Qiyou2(1.Qingdao Oasis Environmental&Safety Technology Co..Ltd.,Qingdao266555,China；2.China University of P e troleum(East China%,Qingdao266555,Cina)Abstract:Based on the composition of crude oil,we selected the model substances,and screened the high ef­ficient degradation strains against each model substance from the petroleum hydrocarbon-degrading strains(S1, S2,S3,S4,S5,and S6)preserved in the laboratory.Moreover,we optimized the compounding of high efficient degradationstrainsanddeterminedtheoptimaldegradationconditionsofthecompoundbacteriabyorthogonal experiments.TheresultsshowthatstrainsS2andS5havethebestdegradatione f ecton monocyclicaromatic hydrocarbons(toluene)strainsS1andS6havethebestdegradatione f ectonpolycyclicaromatichydrocarbons (phenanthrene)andstrainS4hasthebestdegradatione f ectonlong-chainalkanes(para f in wax).Thecom-poundbacteriaofS1!S2andS4havethebestdegradatione f ectoncrudeoilandthebestdegradationcondi-tions are determined as follows：the pH value of7,the substrate concentration of0.4g•L-1,the N/P ratio of7 :1,the inoculum amount of1mL,and the temperature of30b.The effects of various factors on the degrada-Oion raOe of crude oil are inOhe fo l owing order:pH value%OemperaOure%subsOraOe concenOra ion%inoculum a-mounO%N/PraOio.Keywords：petroleum hydrocarbon-degrading bacterium；screening；compound bacteria；orthogonal experi­ment；degradation condition收稿日期2020-09-08作者简介：段潍超（1991—"，男，山东济南人，工程师，研究方向：土壤污染调查与修复，E-mail：dwc8023@foxmai1com&「段潍超，等：石油怪高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化/2020年第12期石油是目前人类使用最为广泛的能源之一，但在开采、储运、炼制及加工过程中，石油因事故、泄漏或排污等不可避免的会进入水体和土壤中，从而污染生态环境(13)。

石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性石油污染是环境污染中的一种常见问题，对自然环境和人类健康造成严重影响。

因此，寻找高效的石油降解菌是解决这一问题的重要途径。

本文从石油污染土壤中分离鉴定了一株降解菌，并探究了其降解特性。

（1）样品的采集及处理从受污染的土壤中取样，再分离出单个菌株。

将样品加入到NaCl0.9%的生理盐水中，摇动15分钟后，离心上清，然后采用1%的蒸馏水进行0.5小时热灭菌。

（2）分离鉴定将上述处理后的样品，分别接种于处理好的LB及玉米精蛋白培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱中培养48h。

在此基础上，通过对菌落形态、菌株生长速度、菌落气味、荧光反应、产酶等特征，对细菌进行鉴定。

最终，筛选出一株石油降解菌。

（3）降解特性分析选取某种石油类物质，将其加入到LB培养基中，最终浓度设置在30mg/L左右。

将选出的石油降解菌接种进去，接种数量为OD600=0.1。

进液管任意长度分别设置于接种前及接种后，能够记录pH值及菌量。

取样分析的样品保持30℃培养48小时，过程中定时测量液体的pH值。

分析降解特性时，发现石油降解菌能够将石油类物质中的碳链分解，并分解成细胞利用的有机物质。

在石油降解过程中，菌落数逐渐增加；液态培养基中pH值不断降低，并最终将其稳定在中性状态。

另外，菌落色素通过两次衍生化反应生成焦磷酸一茎丙酮醇酯，之后通过JB-4消失化学反应结晶，能够得到石油降解特性的分析结果。

综上所述，石油降解菌是一种能够有效降解石油类物质的微生物。

因此，在现实中，可以对这类石油降解菌进行大规模培养及应用，以降低环境中的石油污染。

ｔｅＤａｉ ｏ ｄｄＡ ｅ ． ｈ ｔ ｉ ａ ｄｎｉｅ ａ ｉｕ ｅｕ ｒ ｕｈｍｏｐ ｏｏ ｉ ｌ ｂ ｅ ａｉｎ ｐｙ ｉｌｇｃｌ ｈ ｌ Ｂ ｎ ｅ ｒａ Ｔ ｅｓ ａｎｗ ｓｉｅｔ ｄｔ Ｂ ｃ ｌｓ ｘ ｓｔ ｏ ｇ ｒｈ ｌｇｃ ｓｒ ｔ ， ｈ ｓ ｏ ｉａ ｎ ａ ｒ ｉ ｆ ｏ ｌ ｆ ｌ ｈ ａｏ ｖ ｏ ｏ
Ｕ ｉｅｓ ｆ ｅ ｏｅｍ， ｅ ｉ ０ ０ ３ Ｃ ｉａ ．ｏｌ ｅｏ Ｂｏｏ ｉ ｌ ｃｅｃｓｎｖ ｒｉ ｏ Ｐ ｔ ｌ ｙ ｔ ｒ ｕ Ｂ ｉｎ １０ ８， ｈｎ ；３Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉｌ ｃ ｉｎｅ， ｈｎ Ａｇｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓ Ｂ ｉｎ ｊｇ ｅ ｇ ａＳ ａ ｃ ｕ ｙ ｔ ｊ
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中 国环 境 科 学
２ １，２６ ： １８ ￣ ０ ６ ０２３ （） ０ ０ １ ８
Ｃ ｉ Ｅ ｖｒｎ ｎａ Ｓ ｉ ｃ ｈｎ ａ ｎ ｉ ｍｅ ｔｌ ｃ ｎ ｅ ｏ ｅ
高效稠 油降解 菌 Ｄ １Ｇ 的筛选及降解特 性 Ｌ一
任 妍 君 ，陈梅 梅 ， 一 ， 岳 勇 ， 王 磊 。 ， 王 靖 。 万福 （． ， 王 １ 中国石油集团安全环保技术研究院， 北京
１２ ４ ；２中国石油大学化工学 院， 京 １ ０ ８ ；３中国农业大学生物学院， ０２９ ． 北 ００３ ． 北京 １０ ９ ） ０ ０ １
摘要 ：从 大 连保税 库 区稠 油污 染土壤 中分离 出 １株稠 油降解 菌 Ｄ — ＬＩＧ经 形态 观察 、生化 鉴定 、１ＳｒＮＡ序 列及 系统 发育 分析 ， 该菌 ６ Ｒ 鉴定 株 为弯 曲芽孢杆 菌（ ａｉｕ ｅｕ） 株 Ｄ 一 在 第 ９ Ｂ ｃｌｓｆ ｘ ． ｌ ｌ ｓ 菌 Ｌ１Ｇ ｄ对稠 油 的降解 率为 ３ ．９ 饱 和 烃和 芳香烃 的 总含 量降低 了 ６ ． ％； — ９８％， ８３ ＧＣ ＭＳ分析 ０

收稿日期:2005O 12O 21*国家"十五"攻关项目(2001BA50918)资助**通讯作者金建云,男,1979年生,华中农业大学植物科技学院硕士研究生,武汉430070文章编号 100022421(2006)0420400204高效油脂降解菌的筛选及其降解影响因素的初步研究*金建云1,2)李 芳2) 林开春1,2,3)**(1)华中农业大学植物科技学院,武汉430070;2)武汉天惠生物工程有限公司,武汉430070;3)武汉绿世纪生物工程有限责任公司,武汉430070)摘要 以豆油作为唯一碳源,经过2个月驯化后筛选获得具有高效油脂降解能力的细菌1株,编号为S 16,经鉴定为芽孢杆菌。

对影响S 16降解能力的几个因素进行了初步研究,结果表明,在初始pH 为7.0,初始含油量为400mg/mL,摇床转速为200r /min,培养温度30e 条件下,该菌株生长旺盛,发酵72h 后对豆油的降解率可以达到73.5%。

关键词 油脂;油脂降解菌;降解率;影响因素中图法分类号 Q 939.9 文献标识码 A当代人类面临两大难题,一是环境问题,二是能源危机。

随着人们生活水平的不断提高,含油脂的垃圾产量呈现出直线上升的趋势,单从环境的观点看,它们是一种污染,但是从资源的观点看,它们又是一种可再生的宝贵资源:这些垃圾是油脂含量很高的废弃物,若能将其处理收集起来,它们又是很好的生物柴油生产原料[1,2]。

然而,油脂相对于淀粉、蛋白等有机质要难于降解,酶法制备生物柴油必须获得活性较高的脂肪酶,因此,筛选出高效的油脂降解菌,无论是对环境治理,还是对酶法生产生物柴油,都有着重要的意义。

能够降解油脂的微生物在自然界中广泛存在,各类微生物对油脂的降解能力不尽相同,这主要依赖于微生物群落的种属组成,大量的研究都集中在混合菌株的降解作用研究上,而对单一菌株降解油脂的研究很少[3]。

目前,日本、欧美一些发达国家已将油脂降解菌应用到生物垃圾降解、含油废水的处理、洗涤用酶和生物柴油的生产等多项领域,而我国对于这些方面的应用尚处于初步探索阶段。

渤海湾滩涂高效石油降解菌筛选及其降解性能研究汤瑶;王晓丽;雷霆;崔凯杰【摘要】以渤海湾为研究对象,通过对土著石油烃降解菌群的筛选与分离,为港口海域石油污染以及海洋溢油事故生态修复提供理论指导和技术支持.从天津渤海湾原油污染沉积物中采用富集培养法筛选分离菌株;通过16S rDNA序列分析及分子系统发育树的构建,同时结合形态学观察、革兰氏染色对菌株进行初步鉴定;采用超声-紫外分光光度法分析菌株对石油的降解效果.分离得到一株能以石油为唯一碳源的菌株,命名为D12,初步鉴定为戈登氏菌(Gordoniasp.).菌株D12降解原油的环境条件分别为:初始原油浓度为0.9％,N/P为7∶1,接种量为11％;pH值为9.0时原油的降解率可高达43.98％.【期刊名称】《天津理工大学学报》【年(卷),期】2016(032)001【总页数】5页(P49-52,57)【关键词】原油;戈登氏菌;菌株鉴定;降解特性【作者】汤瑶;王晓丽;雷霆;崔凯杰【作者单位】天津理工大学环境科学与安全工程学院,天津300384;天津理工大学环境科学与安全工程学院,天津300384;天津理工大学环境科学与安全工程学院,天津300384;天津市滨海新区塘沽环境保护监测站,天津300450【正文语种】中文【中图分类】X55为适应经济发展增速，中国加大了对原油的开发与使用.原油运输中的泄漏、采油过程中的井喷、含油工业废水的排放等逐渐成为海洋原油污染的主要源头.目前，生物强化修复模式法在溢油生物修复中有很多优势，即在溢油海面添加多功能的降解菌，来提高只依靠土著微生物降解原油的能力［1］.1971 年，Stackebrandt等［2］研究发现了一个新的种属，即为戈登氏菌属Gordonia.目前，已经发现了戈登氏菌属的23个新种，其中就有来自于海洋环境的［3］、近海岸滩涂［4］、以及原油和多环芳烃污染的土壤中［5］、油井［6］等. Quatrini P和Goodfellow M.等在地中海海岸线和海底沉积物中发现了诺卡氏菌Nocardia，红球菌Rhodococcus和戈登氏菌Gordonia［7-8］.对于戈登氏菌属Gordonia的报道较少［9］，在石油泄漏等污染事故中，石油烃降解菌群在生物修复过程中发挥了巨大作用［10-12］. 1989年美国阿拉斯加Exxon Valdez油轮泄漏污染事件中，海洋环境中的石油烃降解菌群在石油污染清除中发挥了主要作用［11］. 2010年墨西哥湾BP Deepwater Horizon海底石油井喷事件也采用土著菌群进行生物修复［10］.郑立等在大连石油污染滩涂中分离驯化得到的混合菌剂在修复中有效提高了石油降解效率［12］.在实际应用中，添加到石油烃污染环境中的外来降解菌群会对本土种群的生态安全产生影响.本研究着重探讨筛选驯化天津渤海湾滩涂土著石油烃降解菌，并研究不同的环境条件对菌株的降解效果的影响，为渤海溢油事故生物修复提供科学依据.1.1 沉积物样品和原油样品来源表层沉积物样品采至渤海湾（39°00.851′N，117° 49.061′E）海域沉积物.原油样品取自伊拉克巴士拉原油，呈深棕色，且粘稠.1.2 培养基无机盐培养基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，Mg2SO40.5 g，CaCl20.02 g，NH4NO31.0 g，5 mL微量元素混合液，蒸馏水1 L，pH为7.0.微量元素混合溶液：CaCl22 mg/L，FeCl3·6H2O 50 mg/L，CuSO40.5 mg/L，MnCl2·4H2O 0.5 mg/L，ZnSO4· 7H2O 10 mg/L.原油培养基［13］：无机盐培养基，原油.LB液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH为7.0.固体培养基：LB液体培养基，琼脂18 g.1.3 菌株的筛选取一定量原油覆盖于100 g沉积物上驯化2个月，称取5 g渤海湾原油污染沉积物样品置于100 mL原油培养基中，在150 rpm，30℃条件下培养7 d.按1%的接种量转接至新鲜的原油培养基中，转接三次后，用平板稀释法获得单菌落.1.4 菌株的系统发育学与革兰氏染色鉴定用LB固体培养基穿刺培养该菌后，使用DNA提取试剂盒（Takara）进行细菌DNA提取，以正向引物5′-CCC CAC ACA CAT GCA CTT ACC-3′，反向引物5′-CCT ACT CCC AGG GCT TTG ATT-3′进行PCR，PCR反应体系如下：DNA模板1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，PCR Premix 25 μL，ddH2O 23 μL. PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min. PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送大连宝生物进行测序.将测序结果在GeneBank中比对，获得相似性高的种属菌株的16SrRNA序列，利用ClustalX2和MEGA软件将相似种属菌株的基因序列进行比对并绘制进化树.在无菌环境中吸取少量活化后的菌液进行革兰氏染色［14］.1.5 菌株生长曲线的测定向100 mL的1.5%含油无机盐培养基中接种1%（V/V）的D12菌悬液，30℃，pH为7，N/P比为7：1，150 rpm条件下培养.每隔2 h取菌液1 mL，利用稀释平板计数［15］.1.6 原油降解率的测定原油浓度的测定方法为超声-紫外分光光度法测定原油吸光度［16］，CHCl3为萃取剂.原油降解率［17］如下：式（1）中W为空白对照原油的质量，W1为原油降解率测定中三角瓶中残余原油的质量，w为具塞三角瓶的质量，η为原油降解效率.萃取出的残余原油利用紫外分光光度法测定吸光度A，由原油标准曲线算得.1.7 影响石油降解因素试验以原油培养基为培养液，在pH为7，初始原有浓度为1.5%，N/P为7：1，接种量为10%的基础上，分别改变pH、初始原油浓度、N/P、接种量等因素，30℃，150 rpm条件下培养.连续培养一周，取样进行石油降解率的测定.2.1 原油降解菌的形态特征与16S rDNA序列分析菌株D12的菌落呈圆形凸起状，边缘光滑，呈橘红色，为革兰氏染色阳性菌.根据设计的引物，通过PCR扩增得到的约1.4 kb的DNA片段，如图1所示.在图2系统发育树中，D12与Gordonia amicalis strainT3的Bootstrap值为100%，结合生化特性和基因序列结果，确定D12属于戈登氏菌Gordonia amicalis. 2.2 单菌株在含油培养基上的生长曲线由图3可见，菌株D12从接种到第12 h生长缓慢，处于延滞期；24 h后进入对数生长期，生长速度加快；60 h到175 h处于稳定期.从文献中获知戈登氏菌在48 h进入稳定期［18］.D12在较高浓度原油培养液中的生长显得比较缓慢，可能是原油本身的毒性对菌株的生长产生抑制作用.在溢油修复中需要选择生长处于对数期的菌种，株D12培养至48 h进入稳定期，因此D12用于溢油修复中最好的时间是活化培养48 h后.2.3 pH变化对原油降解率的影响pH是影响微生物生长繁殖的一个重要因素［19-20］.由图4可以看出，D12在pH为8.0～1.0的环境中原油降解率明显高于pH在5.0～7.0时，最适pH值是9.0时，原油的降解效率最高，为43.98%，说明碱性环境更有利于D12对原油的降解.2.4 N/P变化对原油降解率的影响溢油修复过程中需要研究经济合理的氮添加比例［21-22］.从图5可以看出，原油降解率随着N/P先增高后降低，N/P为7：1时原油的降解效率最高为43. 12%. N/P为9：1时，降解率有所下降，可能是由于氮元素含量较大导致N/P失衡不适宜微生物的生长，抑制菌株对原油的利用能力.2.5 原油含量变化对原油降解率的影响由图6看出，在原油浓度低于0.9%时，菌株D12对原油降解率较大，当原油浓度高于0.9%时，降解率明显下降.原油浓度在1.2%～1.5%时，原油降解率减小，且幅度较大，可能是由于原油浓度过高，毒性增强，筛选出的降解菌不适应高浓度原油环境，降解率减小［23］.2.6 接种量变化对原油降解率的影响接种量对微生物生长过程有较大影响，接种量大时，微生物的适应期较短［24］.图7显示，接种量在3%～11%内，原油降解率与接种量成正比增加，且接种量为11%时，原油的降解效率最高，为36.28%.当接种量为13%时，原油降解率降低了，培养基环境中的营养物质供应不足，微生物数量较多，导致菌群原油降解率降低.1）依据16SrRNA鉴定结果分析，D12与Gordonia amicalis strain T3的Bootstrap值为100%，结合生化特性和基因序列结果，确定D12属于戈登氏菌Gordonia amicalis.2）D12在24 h后进入对数生长期，60 h到175 h处于稳定期.根据菌种的生长曲线确定采用菌龄为48 h的菌体进行接种.3）D12的最适pH值为9.0，其适宜在碱性环境中降解石油.从N/P对原油降解率影响的研究当中发现菌株D12在N、P添加比例为7：1时降解率最高.4）D12降解原油较适宜的初始原油浓度范围是3～9 g/L.菌株D12的接种量为11%时，原油的降解效率最高.【相关文献】［1］黄建平.海洋石油污染的危害及防治对策［J］.技术与市场，2014，21（1）：129-130. ［2］Tsukamura M. Proposal of a new genus，Gordona，for slightly acid-fast organisms occurring in sputa of patients with pulmonary disease and in soil［J］. Journal of General Microbiology，1971，68（1）：15-26.［3］Soddell J A，Stainsby F M，Eales K L，et al. 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Study on the identification and characteristics of a strain of N-Alkane degrading bacteria TY12 ［J］.Bioprocess，2015（5）：6-13.［15］张秀霞，张守娟，张涵，等.固定化微生物对石油污染土壤生物学特性的影响［J］.石油学报：石油加工，2015，31（1）：112-118.［16］蒋瑞萍，孙丽丽，解开治，等.采用紫外分光光度法评价石油烃降解菌的降解能力［J］.石化技术与应用，2015，33（1）：70-74.［17］高悦，王呈玉，李洪敏，等.原油降解菌的筛选及其降解特性［J］.吉林农业大学学报，2015（1）：77-82.［18］许丽，高振，罗霂，等.一株高效降解芘的细菌分离，鉴定及其降解效果［J］.微生物学报，2011，51（3）：313-319.［19］胡凤钗，李新宇，苏振成，等.三株降解芘的戈登氏菌鉴定及其降解能力［J］.应用生态学报，2011，22（7）：1857-1862.［20］邱清华，哈尼帕，邓绍云.微生物降解石油烃类污染物的研究进展［J］.资源开发与市场，2012，28（2）：144-147.［21］刘伟峰，臧家业，刘玮，等.海洋溢油生态损害评估指标及方法初探［J］.海洋开发与管理，2014（8）：68-75.［22］孙万虹，陈丽华，徐红伟.氮磷含量对微生物修复油污土壤的影响［J］.生物技术通报，2015，31（6）：157-164.［23］何良菊，李培杰，魏德洲等.石油烃微生物降解的营养平衡及降解机理［J］.环境科学，2004，25（1）：91-94.［24］邓绍云，邱清华.石油降解微生物培养试验［J］.辽宁工程技术大学学报：自然科学版，2013（4）：568-572.。

０ ０ ， ２ Ｄ ． １ｇ ＮａＥ ＴＡ ・ Ｈ２ ． １ｇ ２ Ｏ ０ ０ ，蒸馏 水 １ ０ ０ ０ｍＬ和石 油 ，Ｈ 值为 ７ ５ ｐ ．．
分 离培 养基 ： 油培养 基 １０ ０ｍＬ， 油 ０ ６ｇ 琼脂 ２ ． 降 ０ 原 ． ， ０ｇ
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将 ３℃下 生长 ２ ７ ４ｈ的斜 面 菌种无 菌操 作接 种 到装有 １０ｍＬ富集 培 养基 的 ２ ０ｍＬ三 角瓶 中 ， ０ ５ 在 ３ ℃ 、６ ／ ｎ的恒 温摇 床 中好 氧振荡 培养 ２ ， ０ １０ｒｍｉ ４ｈ 然后 将种 子 液离 心 、 用磷 酸盐 缓 冲 液反 复 洗涤 ， 后 最
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第３ ８卷 第 ６期 ２０ ０ ６年 １ ２月
西 建 科 大 学 安 筑 技 学 报（然 学 ） 自 科 版
Ｊ ｘｉａ ｉ．ｏ ｃ ．８ ｃ ． Ｎａｕａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ ． ’ ｎ Ｕｎ ｖ ｆＡｒ ｈ Ｌ Ｔｅ ｈ （ ｔｒｌ ｃ ｎｅＥ ｉｏ ） ｅ ｉ
干燥器 内备 用． １ ２ 培养 基 ．
富集培 养基 （ 富集 培养 基一 般使 用 牛 肉膏 蛋 白胨培养 基 ）－ ： 肉膏 ５ｇ 蛋 白胨 １ ， Ｃ １ ｇ 蒸 ６牛 ］ ， ０ｇ Ｎａ ５ ， 馏 水 １０ ０ｍＬ，Ｈ７２ ． ， 配制 固体培 养基 需另 加入 ２ 脂． ０ ｐ ． —７４ 若 ０ｇ琼 降油培 养基［ ＮＨ４ ３２ｇ Ｏ４１ ５ｇ ＫＨ２ Ｏ ， Ｓ ： ＮＯ ，Ｋ ＨＰ ． ， Ｐ ４３ｇ Ｍｇ Ｏ４・７ Ｏ ０ １ｇ Ｈ２ ． ，无 水 Ｃ Ｃ２ ａ１
存 在试 料袋 中 ， 以备试 验使用 ． 试验所 用 油样 为长 庆油 田的 原油 ， 原油 用石 油醚 （ｏ ６ ￣ 将 ３ － ｏＣ沸程 ） 溶解 ，

第27卷第4期2007年4月环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae C ircu mstanti a eV o.l 27,N o .4A pr .,2007基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .50378077)Supported by t h e NationalNatural S ci en ce Foundati on of Ch i na(No .50378077)作者简介:徐金兰(1973)),女,副教授(博士),E-m ai:l xu jinlan @xauat .edu .cn;*通讯作者(责任作者),E-m ai:l huangti ngli n @xau at Biography :X U J i n l an (1973)),fe m al e ,associat e professor (Ph .D .),E-m ai:lxu ji n lan@xauat ;*Co rres pondi ng author ,E-m ai:lhuangti ngli n@xauat .edu .cn徐金兰,黄廷林,唐智新,等.2007.高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究[J].环境科学学报,27(4):622-628Xu J L ,H uang T L ,Tang Z X ,et al .2007.Isolati on of petrol eum degradati on bacteri a and its app lication to b i ore m ediati on of petroleum-conta m i nated soil[J].A ct a S ci en ti ae C i rcu m s t an ti ae ,27(4):622-628高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究徐金兰,黄廷林*,唐智新,肖洲强西安建筑科技大学环境与市政工程学院,西安710055收稿日期:2006-04-11 修回日期:2006-11-20 录用日期:2007-01-18摘要:从陕北石油污染土壤中富集分离、优选出7株菌株,并进一步研究了7株菌的生理生化特性.菌株鉴定结果表明,SY 21为不动细菌属,SY 22为奈瑟氏球菌属,SY 23为邻单胞菌属、SY 24为黄单胞菌属、SY 42为动胶菌属、SY 43为黄杆菌属、SY 44为假单胞菌属.7株菌的降油试验结果表明,降解8d 后,加菌试样的石油烃降解率均达到80%左右,7株菌的石油烃降解速率高于目前已有的报道.接种量越大,石油菌数量越多,石油烃降解率随接种量的增加而提高.采用SY 43和SY 23菌株对土壤进行生物修复,试验结果表明,投加高效菌株SY 43和SY 23均可在较短的时间内将土壤中的石油污染物去除,去除率可达88.4%和73.4%,其中菌株SY 43的修复效果优于SY 23.关键词:高效降油菌;石油污染土壤;接种量;生物修复文章编号:0253-2468(2007)04-0622-07 中图分类号:X172 文献标识码:AIsolation of petroleu m degradati on bacteri a and its application to bi ore m ediation of petro l eu m-conta m i nated soilXU Jinlan ,HUANG T i n g li n *,TANG Zh i x i n ,XI A O ZhouqiangSchool of Environm en t al and M un ici pal Engi n eeri ng ,X ia 'n Un i versity ofA rch itect u re and T echnol ogy ,Xi c an 710055R ecei ved 11April 2006; received i n revi sed f or m 20Nove m ber 2006; accepted 18J anu ary 2007A bs tract :7strai ns of bacteri a w ere i solated fro m petro l eum-con t a m i nated s o il i n nort h of Shaanxi provi nce and t h ei r phys i ological characteri sti cs w ere i nvesti gated.Resu lts s how ed t hat strai n SY 21w as Acine t obacter sp .,s trai n SY 22N eisseri a s p .,strai n SY 23P lesi omona s sp .,strai n SY 24X an t h o m onas sp .,s trai n SY 42Azotobacter s p.,strai n SY 43F l av obac t eri um sp .,and strai n SY 44P se udomona s .sp ..Re m oval effi ciency of the bacteri a to TP H (Tot alPetro l eum hydrocarbon )reac h ed abou t80%aft er 8days 'i nocu l ation ,w h i ch is h i gher t h an t hat of bacteria report ed .For strai n SY 43,t he more i nocu l ation t he h i gher re m oval effi ciency t o TPH ach i eved.The experi m ent of app licati on strai n SY 43and SY 23t o re m edy p etro l eum-con t am i nated soil i nd icat ed t hat t hey cou l d re m ove 88.4%and 73.4%of TPH,respecti vely w ith i n s hort peri od .The stra i n SY 43w as m ore effici en t i n b iore m ed i ation t h an t h at ofSY 23.K eywords :petroleum-degradati on b acteria;l oi-l conta m i nated s o il s ;i noc u lati on ;b i ore m ediati on1 引言(Introducti o n)随着我国石油工业的发展,受石油污染土地的面积不断扩大,污染程度也日益严重.由于石油的主要成分有烷烃、苯、甲苯、二甲苯等多种复杂芳香烃,这些物质毒性大,有的有致癌致突变作用,进入土壤后难以去除,而且会随着径流进入周围的流域和地下水(黄廷林等,2000;任磊等,2000),从而给油田及周围的生态环境带来了严重的环境问题.石油污染的生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染而被视为一项具有广阔前景的高新技术,近十几年来,在国外得到较大发展.但目前大多数研究是通过添加N 、P 等营养物质刺激土壤中土著微生物的活性,来实现污染土壤的生物修复(何良菊等,1999),但由于土著微生物的生长缓慢、数量有限,往往使生物修复过程受到限制.向石油污染土4期徐金兰等:高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究壤中投加环境适应强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油污染土壤生物修复效率的主要手段.在这方面已取得一定的研究成果,例如美国BG I公司的一项专利技术就是利用混合菌群来促进石油烃的降解(Ba ltic G enera l I nvest m ent Corporation,1996);W ilson等的论文中也报道了几种对PAH s发挥高效降解能力的菌株(W ilson et al,1993).但污染土壤的微生物修复是一项涉及污染物特性、微生物生态结构和环境条件的复杂系统工程,高效降油菌对环境的适应性及其对石油的分解特性都会影响生物修复过程.本文从陕北石油污染土样中筛选高效降油菌株,对其形态及生理特征进行研究,并进行初步鉴定;研究菌株的除油特性及部分菌株的生物修复过程,以期为工程实际提供理论依据.2材料和方法(M aterials and m ethods)2.1原油和石油污染土壤试验用原油取自陕北某炼油厂,试验样点采自延安某采油井周围地区4处被石油污染的土壤,其特性见表1所示.表1采集石油污染土壤的特性Tab l e1Th e characteri sti cs of o i-l conta m i nat ed s oil编号总烃浓度/(m g#kg-1)p H含水率细菌数量/(个#g-1)好氧细菌石油降解菌样点12098.898.3%9.2@1031.3@103样点21488.6615.5% 1.3@1055.6@103样点3281008.5513.9% 4.4@1042.2@104样点45728.9115.1% 3.4@1051.0@1052.2培养基培养基:NH4NO32g,K2H P O41.5g,KH2PO43g, M gSO4#70H2O0.1g,无水CaC l20.01g,Na2EDTA#2H2O 0.01g,原油1g,蒸馏水:1000mL,p H值7.2~7.4.2.3操作方法石油降解菌的富集、分离、纯化:取一定量的石油污染土样接入装有100mL培养基的250mL三角瓶中,于30e、160r#m i n-1条件下在摇床中培养7d;然后取一定量的上述培养液接入装有100mL新鲜培养基的250mL三角瓶中,30e、160r#m i n-1条件下摇床中培养7d;如此共3次.用接种环沾取富集培养液于平板上划线;经过多次划线纯化后,将纯化菌株于试管斜面培养后保存于冰箱(梁生康等, 2004).石油降解菌的复筛:称取含油土样50g,溶于经灭菌的培养基100mL中,配成泥浆,盛于250mL的三角瓶中;在无菌条件下,将制好的菌悬液接种2mL 于三角瓶中,各菌种均做3个平行样,并作加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照.在30e、160r#m in-1条件下于摇床中培养.每2d取1次样,测其石油烃含量,直至其石油烃含量不再有明显变化,筛选出石油烃降解率高的菌种.接种量影响试验的操作方法与菌种复筛的方法相同,不同的是改变接种量和试验土样.样点1、样点2、样点3、样点4的泥浆中石油烃浓度分别为125m g#L-1、56m g#L-1、3245 mg#L-1、209m g#L-1.石油降解菌的生物修复:称取含油土样2kg于圆形瓷盆中,将斜面培养的SY23、SY43进行活化,与锯末(1B7,质量比)制成固体培养基,接入石油污染土壤中.土壤含水率基本保持在20%左右,在自然温度下进行修复.2.4测试项目及方法石油烃的测定:采用非分散红外石油仪测定(中华人民共和国国家标准GB/T16488-1996, 1996).微生物计数:采用平板计数测定泥浆中石油降解菌的数量(俞毓馨等,1990).3结果(R esults)3.1高效降油菌的筛选为了取得高效、彻底的生物修复效果,分离和筛选污染物的高效降解菌种是生物修复的必然要求.本试验从陕北长庆油田石油污染土壤中共获得60个试样,经过3次富集培养以及分离纯化等步骤得到45个单菌株.在此基础上,采用降解石油试验,复筛出7株对石油具有较高降解能力的菌株.表2列出了这7株菌在石油培养基中的生长状况、培养7d时细菌密度、细菌除油率及菌落生长特征.从表2可以看出,7株菌在石油培养基介质中生长良好,对原油可产生一定乳化作用;培养7d时的细菌密度可达107~109个#m L-1,表明7株菌可以利用石油为唯一碳源生长;培养7d后的生物除油率为43.8% ~58.9%,高于石油降解菌B01对胜利油田石油类的降解率(25.8%~32.8%)(林凤翱等,1997),与O-8-3假单胞菌属、海洋细菌SJ-06W、SJ-6及SJ-16A-2对石油类的降解率相当(40.89%~57.65%) (梁生康等,2004;丁明宇等,2001).623环境科学学报27卷表2分离菌株的石油的降解率及生理特征Tab le2The oi-l b iodegrad ati on effi ciency and physiol og i cal trai t of s even strai ns菌株编号菌生长及石油乳化情况培养7d时菌密度/(个#mL-1)培养7d后除油率菌落特征培养3d时菌落直径/mm菌体形状菌体大小/(L m@L m)SY21乳化完全,菌液浓稠 5.3@10743.8%乳白色,表面干燥,不透明,圆形突起,边缘不齐16杆状1.0~1.5@1.5~2.5SY22有少量油膜,油大多呈絮状2.4@10746.7%乳白色,润湿光滑,半透明,圆形,边缘整齐12球状0.5~1.0@1.0~3.0SY23乳化完全,菌液浓稠,有大量泡沫3.6@10958.9%乳白色,表面干燥,不透明,边缘不整齐9圆端直的杆状0.8~1.0@1.0~3.0SY24乳化较完全,油呈絮状 1.2@10745.0%乳黄色,表面干燥,不透明,扁平,边缘不整齐10杆状0.2~0.8@0.6~2.0SY42乳化完全,菌液浓稠 3.2@10847.6%白色透明,润湿光滑,圆形,边缘整齐15直杆状0.5~1.0@1.0~3.0SY43有少量油膜,油大多呈絮状6.7@10853.3%白色透明,润湿光滑,边缘不整齐18杆状0.5~1.0@1.0~3.0SY44油完全分散呈絮状,菌液浓稠9.2@10745.8%乳白色,半透明,润湿光滑,圆形,边缘整齐19短杆状0.5~1.0@1.5~4.0对所筛选的7株菌进行生理生化试验,结果见表3.根据常用细菌鉴定方法(中国科学院微生物研究所细菌分类组,1978),初步确定SY21为不动细菌属,SY22为奈瑟氏球菌属,SY23为邻单胞菌属,SY24为黄单胞菌属,SY42为动胶菌属,SY43为黄杆菌属,SY44为假单胞菌属.可以看出7株高效降油菌均为革兰氏阴性菌,脂解氧化酶试验均呈阳性.这可能是由于革兰氏阴性菌细胞外层是脂多糖,而脂多糖是由脂类和多糖组成的复合物,可以为细胞提供一个既亲水又亲油的两亲分子层;这一方面使其细胞与油滴表面接触,使石油烃易于进入细胞,另一方面,它能降低水-油界面张力,使原油变为由细小油滴构成的乳剂,并扩散进入细胞,加速油的降解(Pri m e et al.,1993).其中黄单胞菌属、动胶菌属、黄杆菌属、假单胞菌属是目前被科研工作者广泛分离得到并研究利用的对象,其余菌株为地区特有的菌株.表3分离菌株的生化特征及鉴定结果Table3The i den tified res u lts of i sol ated strai ns菌株编号革兰氏染色糖酵解脂解氧化酶接触酶牛奶石蕊淀粉水解产吲哚甲基红试验柠檬酸利用菌种鉴定SY21阴性氧化产酸弱阳性阳性胨化不能水解不产阴性可利用不动细菌属SY22阴性无变化阳性阳性胨化不能水解不产阴性不利用奈瑟氏球菌属SY23阴性氧化产酸弱阳性阳性胨化不能水解7d后产吲哚阴性可利用邻单胞菌属SY24阴性氧化产酸弱阳性阳性胨化能水解4d后产吲哚阴性可利用黄单胞菌属SY42阴性无变化阳性阳性胨化不能水解7d后产吲哚阴性不利用动胶菌属SY43阴性氧化产酸强阳性阳性胨化能水解2d后产吲哚阴性可利用黄杆菌属SY44阴性氧化产酸弱阳性阳性胨化能水解7d后产吲哚阴性可利用假单胞菌属3.2高效降油菌对石油的降解能力试验中设置了加氯化汞杀菌对照试验和不加菌的空白对照试样.图1给出了石油烃总降解率随时间的变化.由图可以看出,加氯化汞的杀菌试样在2d后其石油烃降解率为9%,随着降解时间的延长石油烃降解率基本不变,最高为12%.加氯化汞杀菌试样中石油烃减少的主要原因为石油烃挥发和空气氧化的作用.不加菌对照试样2d后的降解率为11%,降解率随时间的延长逐渐增加,降解8d后37%的石油烃被去除,与氯化汞杀菌试样相比有25%的石油烃是在土壤本身存在的微生物的作用下去除.接种SY21、SY22、SY23、SY44的试样在2d后即开始表现较强的降解能力,其降解率达到50%左右.与不加菌对照试样相比40%左右的石油烃是被高效菌降解利用,表明分离得到的株菌能很快适应环境发挥高效除油能力.分析图1还可以看出,加菌试6244期徐金兰等:高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究样的石油烃降解率曲线变化趋势基本一致,降解率随着降解时间的延长逐渐增加;泥浆为微生物生长提供了良好的环境,降解8d 后加菌试样的降解率均达到80%左右,远高于不加菌试样的降解率(37%),表明在降解过程中,发挥主导作用的是高效菌.图1 7株高效降油菌对石油烃的降解率F i g .1 Th e d egradation effici en cy seven stra i ns图2给出了石油降解菌数量随时间的变化,可以看出,随着降解时间的延长细菌数量逐渐增加,加菌试样的细菌数量明显高于不加菌试样.这进一步说明土壤中降解石油的微生物数量较少,接种高效菌可以提高试样中的石油降解菌的数量,实现高效降解.图2 7株高效降油菌的细菌数量F i g .2 The change of bacteria nu m ber不同的微生物对石油烃有着不同的降解能力,在降解过程中起着不同的作用,对7株菌的石油烃降解速率进行计算,结果见图3.从图中可以看出SY 21、SY 22、SY 23、SY 44菌株在第2d 时的降解速率最大,而SY 42和SY 43菌株在第4d 时降解速率达到最大,SY 24菌在第6d 时降解速率达到最大.图3中给出的7株菌的最大降解速率均高于文献报道同类研究的0.01~0.1g #kg -1#d -1(T r uaxxdd et al .,1995;A tlas et al ,1996;Ca l a brese et al .,1991),表明7株菌均能迅速降解石油烃.图3 7株高效降油菌对石油烃的降解速率F i g .3 The degradati on rate ofTP H by seven strai ns日本学者村上昭彦等人(1999)用黄杆菌和柄细菌降解混合烷烃,试验结果表明,细胞最大降解速率为7.92@10-11~4.8@10-10m g #cell -1#d -1;而用假单胞菌降解5种原油获得了最大降解速率(1144@10-10~3.77@10-9m g #cell -1#d -1).林凤翱等人(1997)用海洋丝状菌降解原油的试验结果表明,细胞最大降解速率为7.92@10-7~4.08@10-6mg #cell -1#d -1.图4给出了7种受试菌株的细胞平均降解速率,从中可见,SY 43菌的细胞平均降解速率最高,达到2.34@10-3m g #ce ll -1#d -1;其次为SY 23菌,其细胞平均降解速率为1.50@10-3m g #cell -1#d -1.其余菌株细胞平均降解率为1.15@10-3~4.57@10-4m g #cell -1#d -1,本研究分离的高效降油菌的细胞平均降解率比上述研究结果均高,可望从中获得具有较高应用价值的高效降解石油菌株.图4 7株高效降油菌细胞平均降解速率F i g .4 Average degradation rate of cell by seven strai ns3.3 高效降油菌接种量对不同土壤除油率的影响石油降解菌的数量是影响除油率的主要因素,图5为接种不同菌液量的4种土壤中石油菌的数量及除油率.从图可以看出,接种菌液量越大,石油菌625环 境 科 学 学 报27卷的数量越多.通过增大接种量可以提高土壤中石油菌的数量,同时高的接种量有利于石油烃的降解.图5还表明,除油率随着接种量的增加而增大,表明高的接种量可以增强接种菌与土著微生物的竞争能力,使接种菌迅速适应环境,大量繁殖,发挥高效降解能力.图5 接种量对除油率的影响F i g .5 The effect of i nocu l um on re m oval petrol eum effici en cy由图5可以计算出细菌对4种土壤的石油烃平均降解速率,样点1为3.86@10-4m g #ce ll -1#d -1,样点2为3.43@10-4mg #ce ll -1#d -1,样点3为8.11@10-4m g #ce ll -1#d -1,样点4为 5.86@10-4m g #cell -1#d -1;这表明接种量相同时,不同样点的除油率差别较大,但细胞石油烃平均降解速率差别不大,随泥浆中的石油烃含量的增大而增加.3.4高效降油菌对石油污染土壤的生物修复试验研究根据国内外大量的研究报道,许多环境因素均对接种高效降油菌的除油效果产生影响,为了进一步了解所筛选的菌株在土壤环境中的修复情况,选取SY 43和SY 232株高效菌进行修复试验,结果见图6、7.从试验结果来看(图6),投加高效菌体系的除油率明显高于不加菌的自然体系;降解6d 后,投加SY 43和SY 23去除率分别为17.2%和19.2%,而不加菌的体系几乎没有降解.降解18d 后,投加SY 43菌体系的除油率达到88.4%,投加SY 23菌体系的除油率为73.4%,而不加菌体系经过18d 的降解后,仅有图6 生物修复过程中除油率随时间的变化F i g .6 The change of TP H re m oval effi ci ency duri ng b i ore m ed i ati onprocess37%的石油烃被降解.结果表明,投加2株高效菌的除油效果明显高于不加菌的除油效果,投加SY 43和SY 23菌体系的石油烃平均去除速率分别为0.044g #kg -1#d -1和0.034g #kg -1#d -1,细胞平均降解速率6264期徐金兰等:高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究分别为2.14@10-6和1.64@10-6mg #cell -1#d -1(均低于泥浆试验的结果),进一步表明SY 43的除油能力高于SY 23菌.从细菌数量分析也可以看出(图7),3种处理的微生物数量相差很大.结果表明,投加高效菌的降油菌数量远远高于不加菌的自然体系,投加SY 43菌体系的细菌数量略高于投加SY 23的体系.细菌数量的差异致使3种处理的修复效果不同,可见保持土壤中较高的降油菌数量是实现生物修复的关键.图7 生物修复过程中细菌数量随时间的变化Fi g .7 The c h ange of the nu m ber of bateria duri ng b i ore m ed iati onprocess研究结果表明,投加高效菌株SY 43和SY 23均可在较短的时间内将土壤中的石油污染物去除,实现石油污染土壤的生物修复,其中,菌株SY 43的修复效果优于SY 23.4 结论(Conclusions)1)利用石油烃为唯一碳源的原油培养基,采用连续富集筛选的方法,从陕北长庆油田石油污染土壤中得到7株可高效降解石油的菌株.经初步鉴定7株菌均为革兰氏阴性菌,分别为不动细菌属、奈瑟氏球菌属、邻单胞菌属、黄单胞菌属、动胶菌属、黄杆菌属、假单胞菌属7个不同属.2)7株菌的降油试验结果表明,接种SY 21、SY 22、SY 23、SY 44的试样在2d 后即开始表现较强的降解能力,其降解率达到50%左右;与不加菌对照试样相比,40%左右的石油烃是被高效菌降解利用,降解8d 后,加菌试样的降解率均达到80%左右.7株菌的石油烃降解速率和细胞平均石油烃降解速率均高于目前已有的报道.3)接种量对土壤的除油率影响试验结果表明,接种量越大,石油菌数量越多,除油率随接种量的增加而增大;高接种量可以增强接种菌株与/土著0生物的竞争能力,提高除油效率;接种量相同时,不同样点的除油率差别较大,但细胞平均石油烃降解速率差别不大,随泥浆中的石油烃含量的增大而增加.4)本研究结果表明,投加高效菌株SY 43和SY 23均可在较短的时间内将土壤中的石油污染物去除,实现石油污染土壤的生物修复,其中菌株SY 43的修复效果优于SY 23.通讯作者简介:黄廷林(1962)),男,教授(博导),博士.主要研究方向:水环境修复,水资源保护与水质控制.电话:029-********;E-m a i:l huang ti ng li n @xauat .edu .cn .References :A tl as R M.1996.Petro l eum b i od egradation and oil sp ill b iore m ed i ation[J].O ceanograph i c Literat ure Rev i e w,43(6):628Balti c G eneral Invest m en tC orporati on.1996.M ethod of deconta m i nationof a hydrocarbon -poll u ted environm en t by t h e u se of bact eri al co m pos iti on [P].US Paten t 5494580Calab rese E J ,K osteck P T .1991.H yd rocarbon con t am i nated soil [M ].N e w York :Le w i s Publi shers ,411)421D i ngM Y,H uang J ,L i Y Q .2001.Th e degradati on of crude oil bym ari ne m i croorgan i s m s [J].Acta Scienti ae C iru m s t an tiae ,21(1):85)88(i n Ch i nese)H e L J ,W eiD Zh,ZhangW Q.1999.Research ofm i crob i a l treat m ent ofp etrol eum con t am i nated s o il [J].Advance i n Environm en talS ci ence ,7(3):110)115(i n Ch i nese)H uang T L,Ren L .2000.S i m u l ati ng and modeli ng of the runoff poll u tionof petroleum 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