植物组织培养 第3章 植物组织培养技术——灭菌方法、无菌操作技术(1)

培养材料 的接种
（6）外植体灭菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
备用
常用消毒剂消毒灭菌比较表
消毒剂
使用浓度 （%）
去除难易
消毒时间 （min）
1、MS培养基 ◆无机盐浓度高 ◆高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 ◆含有一定数量的铵盐 ◆营养丰富 ◆不需要添加更多的有机附加物
2、White培养基 ◆1943年由White为培养番茄根尖而设计
◆ 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 ◆无机盐浓度较低
◆使用广泛
◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果
8、琼脂
◆是使用最普遍的凝固剂 ◆用量一般在6—10g/L之间 ◆颜色以浅、透明度高好， 洁净为上品
除了琼脂外，在组织培 养中还可以使用琼脂糖、结 冷胶等。
9、活性炭 ◆吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 ◆抑制外植体褐变 ◆防止玻璃苗的产生 ◆促进培养物生长和分化 ◆促进生根
缺点： ◆没有选择性
N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、 生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有 重要的位置。
P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。
K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等 有密切关系。
Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的 活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；
（参考图）
喷雾消毒器
（参考图）
3、无菌操作设备
超 净 工 作 台
无菌接种箱
4、细胞培养设备 摇床

5、移栽锻炼 将生根的苗从锥形瓶中移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或 塑料布保持80%以上的湿度，2-3天后打开玻璃罩逐渐降 低湿度进行锻炼，直到将罩全部打开处于自然湿度为止。
6、定植 苗健壮后移至土中培养（定植），即可长成植株并开花。
例题：右图是实验室进行植 物组织培养的一般过程。请 回答下列问题：
(3)基本过程
①愈伤组织：由离体的植物组织或细胞经 脱分化 形成的一 种 相对没有分化 的活的薄壁细胞团组成的新生组织。 ②脱分化：又叫去分化，是由_高__度__分__化___的植物组织或细胞产 生_愈__伤___组__织__的过程。 ③再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成_根__或___芽__等器官的 过程。
2、下面是宁夏农林科学院进行苹果试管苗培养的一般过程:
⑴请填写a～c所表示的内容。a. 脱分化 ； b. 愈伤组织 ；c. 再分化 。
⑵实验室一般使用保存的培养基母液来制备MS固体培养基,配制母液 时, 大量元素 、 微量元素 和有机物要浓缩5～10倍。 细胞分 ⑶该过程中a、c的启动关键在于培养基中所加 生长素 和 裂素 的浓度配比。
MS培养基中各成分的作用
植物激素和人工合成的植物激素
植物中存在的天然激素都有相应的使之分解的酶，这样，天 然激素在植物体内作用和存在的时间就较短，而人工合成的 激素在植物中没有相应分解它的酶，所以作用和存在的时间 长，作用效果明显。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
生长素和细胞分裂素在植物组织培养中的相互作用
诱导芽的形成 愈伤组织不分化 诱导根的形成
菊花组织培养操作步骤:
生芽 生根
消毒
无菌水
1
酒精灯火焰 封口膜
生芽

2种激素5种浓度的实验组合 6-BA mg/L） 0 NAA 0 (mg/L) 0.5 2.5 5 10 0.5 1 6 11 16 21 2.5 2 7 12 17 22 3 8 13 18 23 5 4 9 14 19 24 10 5 10 15 20 25
• 完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的 精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试 验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表 时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试 验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多 因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素 所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试 验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍 的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几 种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。
四、广谱实验法
• 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无 机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、 细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高 (H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了 一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一 个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐， 低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有 机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段， 再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养 基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂 素对不同植物的活性有所不同。
• 不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表 2—1)，大多在5、6．5左右，一般培养基皆要求5.8， 这基本能适应大多植物培养的需要。 • pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以 硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高 一些。一般来说当pH值高于6．5时，培养基全变硬； 低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低 pH值(约0.2—0.3个pH值)因此在配制时常提高pH值 0．2—0．3单位。pH值大小调整可用0．1M的NaOH和 0．IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2单 位，lml的HCl可使pH值降低0．2单位。调节时一定要 充分搅拌均匀。

《植物的组织培养技术》1．植物组织培养的理论基础：细胞全能型。

2．植物组织培养的流程：离体的植物组织或细胞→愈伤组织→根或芽等器官3．愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

4．离体的（高度分化的）植物组织或细胞形成愈伤组织的过程，称为脱分化（去分化）。

脱分化产生的愈伤组织继续进行培养形成根或芽等器官的过程叫做再分化。

再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。

5．生物个体发育过程中细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程叫细胞分化。

6．细胞分化本质：基因选择性表达。

7．植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。

8．菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝（生长旺盛嫩枝）作材料。

9．植物的组织培养的培养基：MS 培养基。

10．MS 培养基营养的（一般情况下只有①～⑤）成分：①大量元素是N 、P 、S 、K 、Ca 、Mg ，②微量元素是Fe 、Mn 、B 、Zn 、Cu 、Mo 、I 、Co ，③植物激素，④蔗糖，⑤琼脂，⑥有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素等。

（大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

）11．植物激素主要是生长素和细胞分裂素，是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。

在培养基使用顺序 实验结果 生长素／ 细胞分裂素比值与结果先生长素，后细胞分裂素 有利于分裂但不分化 比值高时 促根分化，抑芽形成先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化 比值低时 促芽分化，抑根形成同时使用 分化频率提高 比值适中 促进愈伤组织生长12．植物组织培养的影响因素：PH 、温度、光等。

13．MS 培养基采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。