番木瓜果胶裂解酶基因片段的克隆及序列分析
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2009年第1期 漳州师范学院学报(自然科学版) No. 1. 2009年 （总第63期） Journal of Zhangzhou Normal University（Nat. Sci.） General No. 63
文章编号:1008-7826(2009)01-0084-04 番木瓜果胶裂解酶基因片段的克隆及序列分析 林 莹1, 2 , 陈晓静2 （1. 漳州师范学院 生物科学与技术系, 福建 漳州 363000；2. 福建农林大学 园艺学院, 福建 福州 350001） 摘 要：以4个不同成熟阶段的番木瓜果肉cDNA为模板，经RT-PCR扩增仅在第四成熟度的番木瓜果肉中得到596 bp的PL基因片段，所得核苷酸序列通过Blast分析，该序列与草莓、拟南芥、芒果、葡萄等果胶裂解酶基因的相似性都较高，均在79 %–82 % 之间. 关键词：番木瓜 ; PL基因 ; RT-PCR 中图分类号: S667.9 Q781 文献标识码: A
1 引言
果胶裂解酶（Pectate lyases, PL）或称为果胶酸裂解酶，是一种能降解植物细胞壁，导致植物组织软化甚至死亡的一种解聚酶[1]，它能催化聚半乳糖醛酸α–（1，4）键的断裂[2]. 果胶裂解酶作用于半乳糖醛
酸的第5位的β–碳原子，使β–碳原子上的H转移到了糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C–4和C–5之间形成了双键[3]. Dominguez-Puigjaner等（1997）首次报道了PL基因的转录与果实成熟软化有关[4]. 他们通过mRNA差异显示筛选，从香蕉果实cDNA文库中克隆出一条编码与果胶裂解酶同源的
cDNA片段（Ban17）. 随后，在香蕉、草莓、葡萄上都报告分离得到了PL基因[4-7]. 最近，通过反义技术已成功地抑制了PL基因在草莓果实中的表达，即在绿果成熟时抑制PL mRNA翻译成蛋白质，最大限度地抑制了由白变红成熟过程中伴随的果实软化现象[8].
有关番木瓜果实成熟与软化的分子生物学研究，前人已经做了大量工作，主要是从果实成熟过程中乙烯形成的机理入手，本研究拟针对番木瓜果实采后的迅速软化问题，采用RT-PCR技术克隆番木瓜果实PL基因cDNA，为进一步将PL基因cDNA和β－半乳糖苷酶基因cDNA构建双价表达载体，转化番木瓜，培育生理上能正常成熟、货架期长、且适于鲜切（Fresh-cut）加工的番木瓜新品种奠定基础. 2 材料和方法
2.1 样品 供试番木瓜“漳红”采自漳州市农科所番木瓜试验园.取4个不同成熟度的番木瓜果肉（见下一页附录1）液氮速冻后放入超低温冰箱保存备用. 2.2 主要试剂及软件 Tris碱、CTAB、 EDTA、IPTG、X–gal、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、乙酸钠、CaCl2、琼脂糖、
琼脂粉、溴化乙锭、氨苄青霉素等为进口分析纯试剂，购于华美生物工程有限公司；氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、冰醋酸、二甲基甲酰胺等为国产分析纯试剂，购于厦门泰京生物技术有限公司；dNTPs购自TaKaRa公司.DNAMAN软件为Lynnon BioSoft Co.Ltd产品.
收稿日期: 2008-01-03 基金项目: 福建省自然科学基金计划资助项目(B0610010) 作者简介: 林 莹(1981-), 女, 福建省云霄县人, 助教, 硕士. 第1期 林 莹 , 陈晓静 : 番木瓜果胶裂解酶基因片段的克隆及序列分析 85 附录 1 四个不同成熟度番木瓜果实彩照 86 漳州师范学院学报（自然科学版） 2009年
2.3 引物 参照香蕉(AF206320 )、草莓(U63550、AF339025) 、辣椒(AF492632)等的PL基因的序列设计一对引物，并送上海博亚公司合成. 保守区上游引物（SP1 ）：5’–CCAATCGACGATTGCTGGCGTTG–3’； 保
守区下游引物（SP2）：5’–GCATCACCTTGTCTCTTGTGTATG–3’，预期扩增片段600bp. 2.4 DNA 扩增和序列测定 采用改良Trizol法提取番木瓜果肉RNA. RT-PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性2 min ；35个扩增循环的94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃继续延伸10 min. 应完成后用1 %琼脂糖凝胶电泳检测. 使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，将PCR产物克隆于pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在培养基上挑取白色菌落，采用PCR方法鉴定重组质粒. 阳性克隆送至invitrogen生物技术公司测序.
3 结果与分析
3.1 总RNA的制备 取4个不同成熟度的番木瓜果肉（A1、B1、C1、D1，具体见附录）制备总RNA ，OD260/OD280分别为：1.85、1.865、1.88、1.90，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测.电泳结果显示有清晰的28S、18S条带，5S条带不明显（图1）.说明所提取的RNA纯度和完整性都较理想，可用于进一步的RT-PCR实验. 3.2 RT-PCR扩增 以上述提取的总RNA 为模板，用所设计的特异引物进行RT-PCR扩增，仅在第四个成熟度（即D1）的番木瓜果肉中得到一个特异的DNA片段（图2），此片段大小与预期扩增片段大小相符. 扩增的PCR产物克隆入pMD18-T，经PCR检测均为阳性. 测序结果显示，该序列由596个碱基组成（图3，Genebank登录号为DQ660903），与芒果、草莓、草莓（PL B基因）、葡萄等其他植物的PL基因相似性分别为：81％、82％、80％、80%；该核苷酸序列编码177个氨基酸（图4），与拟南芥、草莓、芒果、罂粟、芭蕉等PL基因的相似系数分别为：94 %、90 %、88 %、86 %、84 %. 此，表明我们扩增得到的片段是番木瓜果肉的PL特异性片段.
图1 4个不同成熟度番木瓜果肉总RNA电泳图
图2 番木瓜PL cDNA克隆的凝胶电泳 (M.DL2000) 图3 扩增片段测序结果 第1期 林 莹 , 陈晓静 : 番木瓜果胶裂解酶基因片段的克隆及序列分析 87 4 讨论
果实硬度是指果肉抗压力的强弱程度，可作为果实成熟的判断标准之一. 果实软化时在细胞壁中发生的最显著的变化是果胶物质溶液化，同时伴随着细胞壁中胶层的溶解和初生壁的破坏. 研究认为果实的软化与果胶酶及纤维素酶、半纤维素酶等的活性直接相关，果实在成熟过程中酶的活性是基因活化表达的结果.果胶裂解酶属于果胶酶的一种，其主要功能是在果实成熟过程中参与果胶结构的修饰（裂解），以达到果实软化的目的和结果，是一种重要的细胞壁修饰酶（Cell–Wall Modifying Enzyme），其有规律的表达可保证果实的正常、健康成熟. 本文采用4个不同成熟度的番木瓜果肉进行实验，结果只有在第四个成熟度果实（即果实充分成熟，达到最佳食用风味）扩增得到596 bp的PL cDNA序列片段. 番木瓜在达到最佳食用风味的同时也伴随着果实迅速软化，由此我们推测PL基因只有在充分成熟并迅速软化的番木瓜果实中才大量表达，而成熟前期则处于关闭状态或其表达量极低. 有关番木瓜果实软化的分子机制尚未见报道，番木瓜果肉PL基因的克隆将为进一步研究和探讨番木瓜果实软化的分子机理打下基础.
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