熊果酸及五环三萜同类物的研究进展

熊果酸载药纳米微球的制备及其体内外抗肿瘤的效果评价背景:熊果酸是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物。

研究表明,熊果酸具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学效应,其中抗肿瘤是最为突出的作用,其对多种促癌、致癌物有明显抵抗作用,同时对多种肿瘤细胞有明显的细胞毒作用、诱导分化及抗血管形成作用,其防癌抗癌作用已在临床中受到越来越多的重视。

但熊果酸作为脂溶性药物,不溶于水,生物利用度低,严重影响了熊果酸的临床应用。

为了解决上述问题,纳米载药体系以其独特的优势进入了我们的视线。

将纳米技术和药物治疗结合产生的纳米给药系统用于抗肿瘤纳米药物的设计是目前研究的热点。

高分子纳米给药体系除了具有增加药物的溶解度,缓释、控释等传统药物输送体系所具有的作用外,由于其自身的特殊性,在药物输送中体现出许多特有的应用优势,如载药纳米微球可以延长其体内的循环时间,提高药物的吸收和生物利用度,且增加了对肿瘤病灶部位的靶向性等,这为肿瘤治疗提供了一种新的思路。

目的:本研究分别选用聚己内脂-聚乙二醇(m PEG-PCL)和聚己内脂-聚乙烯吡咯烷酮(PVP-PCL)两种高分子聚合物作为药物载体,构建两种高载药量的熊果酸载药纳米微球,通过测量其理化性质、考察其稳定性、释放性质,并且分别在胃癌和肝癌细胞上验证其抗肿瘤的优越性,为这种新型的控释纳米给药系统的进一步开发提供科学根据。

方法:采用开环聚合法制备m PEG-PCL和PVP-PCL两种高分子聚合物,采用溶剂分散法制备两种熊果酸载药纳米微球。

通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察纳米微球的形态,并用动态光散射仪测定纳米微球的粒径。

测定并计算得出纳米微球的载药量和包封率,并且测定两种载药微球的体外释放曲线。

在体外细胞及体内动物模型上研究两种熊果酸载药纳米微球的抗肿瘤效果并探讨其可能的抗肿瘤机制。

结果:第一,成功制备了负载熊果酸的m PEG-PCL 纳米微球,通过对其表征检测发现其为表面光滑的不规则的圆形,其粒径为144.0±4.0 nm。

熊果酸抗肿瘤对小鼠肿瘤生长和肺转移作用摘要：目的：探讨熊果酸抗肿瘤对小鼠肿瘤生长和肺转移的作用。

方法：建立60只荷H22肝癌小鼠模型，并将60只实验小鼠平均分为试验1组、试验2组，给予试验1组小鼠熊果酸灌胃，给予试验2组小鼠环磷酰胺灌胃，灌药周期均为两周，末次灌药24小时后，将两种试验小鼠处死，称量小鼠肿瘤病灶质量，对小鼠肿瘤病灶进行病理学检查。

结果：经称量得出试验1组小鼠肿瘤质量明显轻于试验2组小鼠（P<0.05），病学检查结果显示试验1组小鼠的肿瘤细胞数量明显少于试验2组小鼠（P<0.05），试验1组小鼠的肿瘤肺转移发生率为10.0%，低于试验2组小鼠的30.0%。

结论：熊果酸能够抑制荷H22肝癌小鼠肿瘤生长和转移。

关键词：熊果酸；荷H22肝癌小鼠；肿瘤生长；肺转移；作用肝癌是我国临床十分常见的一种恶性肿瘤疾病，具有治疗难度大、病死率高等临床特点，严重威胁患者生命健康[1]。

现阶段手术联合术后辅助放化疗是我国治疗肝癌患者的常用方法，但较长一段时间的临床应用发现，放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时，也对机体正常细胞造成了不同程度的损害。

熊果酸是一种自植物中提取出来的五环三萜类化合物，近年来大量临床研究报道该种化合物具有良好的抗癌功效，且不良反应少[2]。

为进一步明确该种化合物在恶性肿瘤疾病治疗中的应用价值，我院开展了动物实验研究，现将研究过程及结果做出以下整理汇报。

1资料与方法1.1一般资料实验动物：60只SPF级雄性昆明小鼠，体质量20～25g，周龄6～8周。

1.2研究方法将生长良好的H22肝癌小鼠在无菌条件下解剖，吸取小鼠腹水，并在腹水中加入适量生理盐水进行稀释，调整成每毫升有2x107肿瘤细胞的混悬液，染色后检查存活肿瘤细胞数，确保存活细胞率大于99%。

建立荷H22肝癌小鼠模型，具体建立方法为在每只实验小鼠的腋窝下注射0.2ml肿瘤细胞混悬液。

培养一周后，将60只实验小鼠随机分为试验1组和试验2组，给予试验1组小鼠熊果酸（白色粉末；纯度98%，溶剂：花生油）灌胃，用量为150mg （kg•d），给予试验2组小鼠环磷酰胺（国药准字H20084188；生产单位：浙江海正药业股份有限公司）灌胃，用量为25mg（kg•d）。

萜类化合物萜类化合物是天然物质中最多的一类化合物。

如：挥发油、树脂、橡胶以及胡萝卜素等萜类成分中，有些具有生理活性，如：龙脑、山道年和川楝素（驱蛔）、穿心莲内酯（抗菌)、人参皂苷以及甘草酸等1.萜类的定义2萜类的结构分类根据组成分子的异戊二烯单位的数目可将萜分成以下几类：单萜：含有两个异戊二烯单位，它包含开链单萜，单环萜，二环单萜三种。

倍半萜：含有三个异戊二烯单位的萜。

双萜：含有四个异戊二烯单位的萜。

三萜：含有六个异戊二烯单位的萜。

以此类推。

这些萜类和单萜一样，也有开链和成环之分。

3. 萜类化合物的理化性质（一）物理性质1.性状（1）形态：单萜、倍半萜—多具有特殊香气的油状液体；常温可挥发或低熔点的固体。

沸点：单萜< 倍半萜（分子量、双键的增加—挥发性降低，熔点和沸点增高—用分馏法进行分离。

）二萜和二倍半萜—多为结晶性固体。

（2）味：多具苦味（萜类又称苦味素）（3）旋光和折光性：多具有不对称碳原子，且多有异构体。

（4）溶解度：萜类亲脂性强—易溶醇及脂溶性有机溶剂难溶水；具内酯结构的萜类—溶于碱水，酸化析出（用于分离纯化）；萜类对高热、光和酸碱较为敏感，或氧化，或重排，引起结构改变。

（二）化学性质1.加成反应2.氧化反应3.脱氢反应4.分子重排齐墩果酸和熊果酸研究进展萜类化合物是所有异戊二烯聚合物和衍生物的总称。

按异戊二烯单位的多少，可将常见萜类化合物分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和多萜，每类再根据基本碳链是否成环及成环数的多少进一步分类。

三萜类化合物广泛存在于多种植物中，种类繁多，其中，最常见的是五环三萜中的齐墩果烷型和乌苏烷型，其代表化合物分别是齐墩果酸（OA）和熊果酸（UA）及其衍生物。

齐墩果酸和熊果酸属于五环三萜类化合物，是由6个异戊二烯单位、30个碳原子组成。

1理化性质齐墩果酸(别名土当归酸，oleanolic acid OA)和熊果酸(乌索酸，ursolic acid,UA)是五环三枯类化合物，为两个同分异构体，广泛存在于自然界且具有多种生物活性。

桂花果实不同部位化学成分及药理活性研究进展桂花是木犀科植物，种类繁多，花香宜人，为我国南方常见观赏性植物[1]。

桂花的根、花和果实均具有药用价值。

目前关于桂花的研究主要集中在桂花中化学成分的提取分离及药理活性研究，对桂花果实的研究较少。

桂花果实呈椭圆形，春季结果，初期青绿色，4月中下旬果实成熟后变为紫黑色。

桂花果实从外向内分为桂花果皮、桂花果肉、桂花籽。

桂花果实具有温中散寒、行气止痛之功效，可用于治疗咳嗽、心绞痛等[2]。

桂花果实成熟后大都脱落至地，无人问津，既浪费了药用资源，又污染了环境。

为了促进桂花果实的开发利用，本文从桂花果皮、桂花果肉、桂花籽以及桂花全果4个方面对其化学成分及药理活性进行综述，为桂花果实的开发利用提供理论依据。

1桂花果皮的化学成分及药理活性目前关于桂花果皮的化学成分研究比较深入的主要在其两种色素：红色素与黑色素。

PAN Y M 等[3]从桂花果皮中分离纯化得到34.6%红色素，且红色素可溶于酸性溶液、碱性溶液及亲水性有机溶剂，耐热性较好，对盐、有机酸及常见的金属离子较稳定，但容易被高锰酸钾、次氯酸钠及重铬酸钾等氧化剂氧化。

活性测试表明，桂花果皮中红色素对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-DiPhenyl-2-PicrylHydrazyl ，DPPH ）自由基和羟自由基具有较好的清除作用，当红色素质量浓度为0.03μg/mL 时，其对羟自由基的清除率为92.3%。

王恒山等[4]采用碱性溶液提取、酸水解、多种有机溶剂萃取沉淀等方法，首次从桂花果皮中分离纯化得到天然黑色素，含有大量铁、锰、铜等微量元素。

抗氧化活性测试表明，桂花果皮黑色素还原性强于抗氧化剂二丁基羟基甲苯（Butylated Hy -droxyToluene ，BHT ），能够较好地抑制蛋黄脂质过氧化，当桂花果皮黑色素的抗氧化活性与抗坏血酸（即维生素C ）相当时，二者质量的数值关系[5]为m 维生素C =0.24m 黑色素+0.01.（1）式中：m 维生素C 为维生素C 的质量，mg ；m 黑色素为黑文章编号：1674-9146(2020)12-067-03李亚军1，黄国保2，3[基金项目]国家自然科学基金项目地区基金项目（21961042）；湖南省教育厅科学研究项目（19C0648）；广西农产资源化学与生物技术重点实验室开放基金项目（2019KF09）；湖南环境生物职业技术学院院长青年基金课题资助项目（Z2015-09）；衡阳市2019年指导性项目（111）；湖南环境生物职业技术学院支柱工程项目收稿日期：2020-10-11;修回日期：2020-11-16作者简介：李亚军（1986-），女，湖南衡阳人，硕士，讲师，主要从事天然药物开发与利用研究，E-mail ：****************。

实验三齐墩果酸的提取、分离及鉴定一、实验目的1、掌握三萜皂苷元的提取、分离和鉴定技术，熟悉三萜皂苷的性质。

2、掌握两相溶剂水解方法。

3、掌握碱溶盐析法提取萜类化合物的方法。

齐墩果酸又名庆四素，属五环三萜类化合物，广泛分布于植物界，已报道其以游离态、酯、苷或兼有的形式存在于150多种植物中，而多数是以苷的形式存在。

但含齐墩果酸的量超过10％的甚少。

从刺五加、龙牙楤木中提得率超过10％，纯度达95％以上，是理想的药用资源，是一种天然产物化学成分，并己证实其具有多种生物活性。

纯齐墩果酸是白色簇状结晶，无色、无味、无臭，熔点为308-31O℃，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿等有机溶剂。

据研究证实，齐墩果酸具有消炎抑菌、增强免疫功能、降转氨酶、改善肝功能，纠正体内异常蛋白代谢，防止肝硬化、降血糖、降血脂等多方面的临床药理作用，它对急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎疗效显著，是国内研制的保肝、治疗肝炎的有效药物之一。

此外，齐墩果酸还具有抗血栓形成、抗突变、抗艾滋病、抑制HIV-I的复制作用；以及强心、利尿和抑制S180瘤株生长等作用，其毒性小，副作用低，安全范围大。

齐墩果酸还因其有抗衰老、抗突变、清除自由基的作用，还可以作为化妆品成分被广泛应用。

女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait．的干燥成熟果实，为常用的扶正固本中药。

药理研究表明其促进免疫的主要有效成分为齐墩果酸、熊果酸及乙酰齐墩果酸。

齐墩果酸以游离态和结合成苷的形式同存于女贞子中。

经检测发现其齐墩果酸含量以幼果期（8月）含量最高，可达8.04％，随着发育成熟下降到 2.5％左右。

其在果实中的含量分布为外中果皮>全果实>内果皮>种仁。

女贞子还含橄榄苦苷、D-甘露醇、硬脂酸、植物蜡等。

女贞子中主要有效成分：（1）齐墩果酸：C30H48O3，白色针状结晶（95％乙醇），mp 305-306℃。

可溶于热甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等，不溶于水。

齐墩果酸和熊果酸保护神经的药理作用综述齐墩果酸（oleanolic acid）和熊果酸（ursolicacid）同属五环三萜酸类化合物，它们又是同分异构体，因此药理作用几乎相同。

现已证实齐墩果酸和熊果酸都具有抗炎、降糖、调脂、抗肥胖、抗动脉粥样硬化药理作用[1-4],有望成为抗代谢综合征新药。

代谢综合征可诱发神经系统方面的并发症，如脑中风、疼痛、糖尿病脑病、痴呆等。

我国正在步入老龄社会，尤其是很多大城市已经进入老龄社会，老年性神经精神疾病如老年痴呆、帕金森病等发病率快速增长，而目前又缺乏安全有效、毒副作用低的防治老年性神经精神疾病药物。

齐墩果酸和熊果酸除了通过抗代谢综合征阻滞神经系统并发症外，已有大量实验研究发现齐墩果酸和熊果酸具有神经保护作用。

本文综述齐墩果酸和熊果酸保护神经细胞、镇痛、抗精神失常、改善学习记忆等神经精神药理方面的研究进展，为齐墩果酸和熊果酸防治老年痴呆、帕金森病和抑郁症的研发提供依据。

1 对离体神经细胞的保护β 淀粉样肽、过氧化氢、谷氨酸、6-羟基多巴胺等都具有神经毒性作用，能直接损伤神经细胞引起的神经元凋亡和神经功能障碍。

齐墩果酸和熊果酸对这些神经毒素引起的离体神经细胞损伤都有保护作用。

1.1 对抗β 淀粉样肽的神经毒性PC12 细胞源自大鼠髓质嗜铬细胞瘤，为神经源性细胞，具有多巴胺能神经特性，被广泛用作神经细胞体外模型，常被用来筛选神经保护药物。

齐墩果酸（20、40、80 mg/L）预处理PC12 细胞，可浓度相关地对抗β 淀粉样肽诱导乳酸脱氢酶渗漏，提高PC12 细胞存活率，降低细胞凋亡率。

这种神经保护作用可能与齐墩果酸促进抗凋亡基因bcl-2 表达，抑制促凋亡基因bax 表达有关[5].Hong 等[6]报道熊果酸0.5~125 μmol/L浓度相关的抑制β淀粉样肽诱导PC12 细胞产生活性氧，从而减少DNA 断裂和细胞凋亡。

也可通过抑制上游激酶ERK1/2、p38和JNK 磷酸化，阻滞核因子-&kappa;B（NF-&kappa;B）的p65亚单位核易位，抑制β 淀粉样肽诱导PC12 细胞表达诱生型一氧化氮合酶和环氧化酶-2,阻止神经炎症反应发生[7].Wilkinson 等[8]报道熊果酸阻滞β 淀粉样肽与小神经胶质细胞结合并抑制活性氧生成。

熊果酸和齐墩果酸的抗消化系肿瘤作用摘要熊果酸（UA）和齐墩果酸（OA）广泛存在于蔬菜、水果和中药材中，是生物活性广而又低毒的天然化合物。

体外实验证明，UA和OA通过诱导癌细胞凋亡和坏死抑制胃癌、肠癌、肝癌等消化系肿瘤细胞增殖。

UA和OA还有抗诱变、抗促癌和增强机体免疫作用。

因此，UA和OA有望成为临床防治消化系肿瘤的药物。

关键词熊果酸齐墩果酸抗肿瘤作用熊果酸（ursolic acid，UA）是化学结构类似于甘草次酸（即甘草酸的苷元）的五环三萜类天然化合物，齐墩果酸（oleanolic acid，OA）是化学结构十分类似于UA的同分异构体。

两者广泛存在于植物中，并像甘草酸那样具有广泛的生物活性，如保肝、抗炎、抗变态反应、抗病毒、抗菌和抗肿瘤作用[1～4]等。

本文仅综述UA和OA抗消化系肿瘤的药理作用。

1 抗胃癌作用UA浓度和时间依赖性抑制人胃癌BGC-823细胞增殖，处理12、24、36和48 h时的半数抑制浓度（IC50）分别为59、43、38和32 μM。

在UA作用下，BGC-823细胞核体积变小、皱缩，其染色体呈浓染的块状和颗粒状，聚集于核周边或裂解成碎片，并出现凋亡小体，琼脂糖凝胶电泳可呈现DNA凋亡梯带。

流式细胞仪分析发现，UA浓度依赖性提高细胞亚G1峰（细胞凋亡率），G1期细胞数下降，细胞周期滞留在S期。

蛋白印迹检测发现，UA浓度依赖性下调BGC-823细胞内凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，促进线粒体释放细胞色素C，下调生存素（survivin）表达，从而激活下游的半胱天冬酶-3活性；UA也浓度依赖性激活半胱天冬酶-8活性，从而也激活下游的半胱天冬酶-3，引发癌细胞凋亡[5，6]。

UA也浓度和时间依赖性抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，作用12、24、36和48 h时的IC50分别为58、34、28和25 μM。

SGC-7901细胞漂起，变圆、肿胀或缩小，染色质浓缩、断裂，凋亡小体形成。

积雪草三萜类成分生物合成研究进展目录一、内容简述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2 （一）积雪草概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2 （二）三萜类化合物简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 （三）研究意义与价值．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 二、积雪草三萜类成分概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4 （一）积雪草中的三萜类成分．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4 （二）结构特点与分类．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5 （三）生物活性与药理作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6 三、积雪草三萜类成分的生物合成途径．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8 （一）甲羟戊酸途径．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8 （二）鲨烯合成途径．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9 （三）其他潜在途径．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9 四、积雪草三萜类成分生物合成的分子生物学研究．．．．．．．．．．．．．．10 （一）基因克隆与表达．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11 （二）基因编辑技术应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12 （三）转录组学与蛋白质组学分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13 五、积雪草三萜类成分生物合成的代谢调控．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14 （一）激素调控．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15（二）环境因子影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．16（三）微生物群落作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17六、积雪草三萜类成分生物合成的人工模拟与改造．．．．．．．．．．．．．．18（一）体外模拟体系建立．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19（二）基因工程菌构建与应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20（三）代谢工程策略探讨．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21七、积雪草三萜类成分的生物转化与修饰．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22（一）微生物转化研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23（二）酶催化反应优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24（三）结构改造与功能拓展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．25八、积雪草三萜类成分的生物制药与开发前景．．．．．．．．．．．．．．．．．．26（一）药物靶点与候选化合物筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27（二）药物设计与合成策略．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28（三）临床试验与安全性评价．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29九、总结与展望．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30（一）研究进展总结．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31（二）存在问题与挑战．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31（三）未来发展方向与前景展望．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32一、内容简述积雪草三萜类成分是一类具有重要生物活性的天然产物，广泛存在于积雪草等植物中。