PAG-ELISA在奶牛早期妊娠诊断上的应用研究
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基础科学 中国畜牧兽医文摘２０１５年３１卷第３期
ＰＡＧ—ＥＬ Ｉ ＳＡ在奶牛早期妊娠诊断上的应用研究
肖胜南张云卿侯婷王巍薛飞王瑾杨龙峰
（北京市延庆县动物疫病预防控制中心，北京１０２１００）
［摘要］本课题研究旨在针对人工榆精后的２８～４５ ｄ的奶牛，分别采用ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ方法和Ｂ超检测进行早期妊娠诊断，比
较实验结果，评价ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ检测方法对配种２８～４ ５ ｄ的奶牛进行早期妊娠诊断的准确性。结果表明，ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ妊娠诊断的特
异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性分别为９３．２％、１ ００％、１ ００％、９７．４％和９８．１％，Ｋａｐｐａ为０．９５２。ＰＡＧ—ＥＬＳＩＡ检
测方法和Ｂ超妊娠诊断结果符合率高，可用于母牛的早期妊娠诊断。
［关键词］ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ Ｂ超检查早期妊娠诊断
开展精准及时的奶牛早期妊娠诊断在现代规模养殖场中对于
易流产母牛的保胎、牛群的分群管理及提高繁殖效率等有着举足
轻重的作用。目前，国内主要依赖Ｂ超、直肠触诊进行奶牛早期
妊娠诊断，而国外奶牛养殖发达国家除了采取Ｂ超、直肠触诊进
行奶牛早期妊娠诊断外，采取检测血液中妊娠相关糖蛋白（ＰＡＧ—
ＥＬＩＳＡ方法）进行奶牛早期妊娠诊断，并得到快速推广与应用。
据相关资料调查，国内某些大型牧场也开始使用ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ方法
进行奶牛早期妊娠诊断，但对其临床使用效果及其影响评估资料
甚是欠缺。 为了分析、利用、评估ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ检测奶牛早期妊娠诊断的
实际应用效果与影响，笔者通过Ｂ超、妊娠相关糖蛋白ＥＬＩＳＡ两
种方法临床试验比较研究，于２０１４年１～５月对延庆县４个牛场２６０
头配种后２８～４５ ｄ的荷斯坦奶牛使用基于妊娠相关糖蛋白ＰＡＧ—
ＥＬＩＳＡ的商品化试剂盒进行早期孕检诊断，并在采集血样的同一
时间开展Ｂ超妊娠诊断确认，比较分析快速ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ的实际应
用效果与影响，为ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ推广应用提供参考依据。
Ｉ材料与方法
１．１试验动物
选取配种后２８～４５ ｄ的荷斯坦黑白花奶牛２６０头，采集静脉血
液４ ｍｌ，送检实验室进行ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ快速妊娠诊断。
１．２试剂
牛怀孕检测试剂盒由北京爱德士元亨生物科技有限公司提 供。批次ｏ４—４１ １６９—０２，有效期至２０１４年５月３１日。
１．３ ＰＡＧ－ＥＬＩＳＡ方法原理
反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞
融合时，会释放包括ＰＡＧ在内的物质到母畜血液中。ＰＡＧ的浓度
随着妊娠开始呈缓慢上升，直至分娩；相关研究表明，配种１个月
后妊娠奶牛与非妊娠奶牛ＰＡＧ浓度出现显著差异。因此，在此时
检￣Ｉ］ＰＡＧ可以成为尽早诊断奶牛妊娠与否的关键指标。ＩＤＥＸＸ牛
怀孕检测试剂盒是根据酶联免疫反应原理设计的，用于检测妊娠 早期存在外周循环中的ＰＡＧ，通过微孔板包被纯化的ＰＡＧ抗体，
捕获到的外周循环中的ＰＡＧ可以与特异性的纯化的ＰＡＧ抗体和辣
根过氧化物酶标记物结合，随后加人ＴＭＢ底物溶液显色，孑Ｌ内溶
液的颜色深浅与样品中ＰＡＧ的含量成比例，此判断妊娠与否。
１．４ ＩＤＥＸＸ牛怀孕检测试剂盒操作步骤及结果判读
将待检奶牛血清和ＩＤＥＸＸ牛怀孕检测试剂盒恢复到室温，按
照试剂盒说明书操作步骤进行，检测待检奶牛的妊娠状况。
阳性对照的平均值（ＰＣ）与阴性对照的平均值（ＮＣ）之差必
须大于或等于０．３００，另外，阴性对照的平均值（ＮＣ）必须小于或
等于０．１５０，实验结果才有效。
具体结果诠释方法为：动物的怀孕状态是南计算每份样品的
Ｓ－Ｎ值决定的。被检样品的Ｓ—Ｎ值＜Ｏ．３００的，检测结果为阴性，
表示此动物没有怀孕（空怀）；被检样品的Ｓ—Ｎ值≥０．３００的，检
测结果为阳性，表示此动物被认为是怀孕。
１．５奶牛怀孕Ｂ超检查结果判断
经过ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ妊娠诊断，做好相关检测结果，并在同一时
间进行Ｂ超妊娠诊断确认。Ｂ超妊娠诊断未怀孕奶牛为空怀牛，若
怀孕诊断为妊娠牛。
１．６结果分析
在结果判定中，特异性为空怀牛样品中ＰＡＧ检测结果为阴性
的比例；敏感性为妊娠牛样品中ＰＡＧ酶联免疫法检测结果为阳性
的比例；结果的阴性预测值为ＰＡＧ检测为空怀的牛确定为真实为
空怀的比例；结果的阳性预测值为ＰＡＧ检测为已孕的牛确定为真
实妊娠的比例；结果的准确性为ＰＡＧ检测的妊娠状况（妊娠＋空
怀）与Ｂ超诊断结果一致的比例。
１．７统计与分析指标
利用Ｋａｐｐａ值对怀孕相关蛋白ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ同Ｂ超诊断结果进行
一致性评价。Ｋａｐｐａ值为１表明完全符合，０为完全不符。在比较
性试验中，Ｋａｐｐａ值在Ｏ．４～０．５之间，说明符合率中等；Ｏ．５～０．６说
明符合率良好；大于０．６说明符合率很高。
基金项目：得到现代奶牛产业技术体系北京市创新团队，２０１ ３ｇ－国家自然科学基金项目（７１ ３ ７ ３０２ ５），２ ０１Ｏ年教育部新世纪优秀人才支持计划
项目（ＮＣＥＴ一１ ０－００９资助）。 作者简介：肖胜南（１ ９８１一），研究生，研究方向：动物疫病诊断与畜牧技术推广。
通讯作者：杨龙峰（１ ９７６－），男，研究生，研究方向：动物疫病防制及畜牧技术推广
（３）采血用的试管必须清洁无菌，最好用一次性真空采血
管，每采集一头（只）动物，必须更换采血针头。
（４）每头（只）动物采血量必须在３ ｍｌ以上，采完血的试
管必须按规定编号，然后静置１０—１５ ｍｉｎ，使血液凝固，才能带
走。
・３８・ （５）在血清还没有析出前，不能把所采血液放入冰箱，以免
红细胞破裂发生溶血现象，待血清析出或分离后，要在２４ ｈ内把
血清倒入１．５～２ ｍｌ弹头离心管内，并按原编号编好号，若不能立
即做检（监）测试验，把分离好的血清冷冻保存。
中国畜牧兽医文摘２０１５年３ｌ卷第３期 基础科学
２结果与分析
在试验期间，对２６０头奶牛分别使用Ｂ超检查（配种后２８ ４５
ｄ）和ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ试剂盒２种方法进行妊娠诊断，对获得的结果进
行比对分析。检测结果：利用ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒共检测出６９头奶
牛阴性（空怀），１９ｌ头奶牛阳性（怀孕）。在用Ｂ超检查时发
现，使用ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒检测为阴性（空怀）的６９头牛全部为
空怀。
ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ检测为阳性（怀孕）的１９１头牛中，用Ｂ超检查
时发现其中的１８６头已孕，而５头为空怀。为了分析ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试
剂盒检测结果的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准
确性，建立了２ Ｘ ２ＹＵ联表（见表１），并在表２中列出了以Ｂ超为
标准，评估ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒的准确性。
从表１可以得出，ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒妊娠诊断的特异性、敏
感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性分别为９３．２％、１００％、
１００％、９７．４％和９８．１％，Ｋａｐｐａ为０．９５２。ＰＡＧ ＥＩＪＳＩＡ试剂盒和Ｂ超
妊娠诊断结果符合率极高
为了解ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ妊娠诊断结果的特异性①、敏感性②、阴
性预测值③、阳性预测值④和准确性⑤的２ Ｘ ２列联表评估表（Ｎ
＝２６０），详见表１。
表１ ＰＡＢ－ＥＬ Ｉ ｓＡ妊娠诊断和Ｂ超妊娠诊断情况比较
注：①Ｂ超诊断为空怀的牛只，ＰＡＧ检测结果为阴性的比例［ｄ／
（ｄ＋ｂ）１×１ｏ０；②Ｂ超诊断为妊娠的牛只，ＰＡＧ检测结果为阳性的比
例【ａ／（ａ＋ｃ）］ｘ １００；③ＰＡＧ检测为空怀的牛只，最终确定为真实为空
怀［ｄ／（ｃ＋ｄ）】Ｘ １００；④ＰＡＧ检测为妊娠的牛只，最终确定为真实妊
娠【ａ／（ａ＋ｂ）］／Ｘ １００；⑤妊娠状况（妊娠＋空怀）与Ｂ超检测结果一致
的比例【（ａ＋ｄ）／Ｎ】Ｘ １ｏ０。 人工配种后通过Ｂ超诊断评价ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ方法的特异性、敏
感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性，结果详见表２。
表２ Ｂ超评价ＰＡＧ—ＥＬ ｌ ｓＡ方法的结果统计
本研究结果表明：两种妊娠诊断方法的一致率＝（ａ＋ｄ）／
Ｎ＊ＩＯ０＝（１８６＋６９）／２６０＝０．９８１。表１数据代￣Ｋａｐｐａ方程，Ｋａｐｐａ值
为０．９５２，分析得出，本试验表明ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ方法和Ｂ超诊断两种
妊娠诊断结果符合率很高，应用ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ方法完全能够用于奶
牛早期妊娠诊断。
在本研究中，ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒检测母牛妊娠诊断的特异
性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性分别为９３．２、
１００、１００、９７．４和９８．１，与Ｂ超诊断结果相同，表明该方法可用
于奶牛的早期妊娠诊断。ｓｉｌｖａ等评估ＰＡＧ￥０断妊娠状况准确性
试验中得出，ＰＡＧ检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值、 阴性预测值和准确性分别为９６．８％～９８．９％、９１．７％～９７．３％、
８９．７％～９３．８％、９７．５％一９９．５％和９３．９％～９７．８％，本研究与Ｓｉｌｖａ
等的研究一致。数据表明采用ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒检测奶牛早期妊
娠诊断的敏感性和阴性预测值均很高，便于筛查空怀牛，利于让
技术员查找原因，尽早采取相关措施，如病原性开展治疗、健康
的准备再次配种，以缩短产犊间隔，提高牧场的生产效益。
３讨论
据资料调查，扬州大学动物科学与技术学院贾国慧、王杏
龙、王亮等在《奶牛Ｂ超妊娠诊断应用研究》的比较实验中，Ｂ
超在奶牛配种后２９～６０ ｄ诊断准确率均为１００％，故本实验选择在
２８～４５ ｄ期间采用ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ与Ｂ超同一时间进行妊娠诊断，在
保证时间的统一下也保证Ｂ超检测结果的准确性。阳性预测值没
有达到１００％，这可能是在奶牛怀孕早期，胚胎早期死亡，用Ｂ超
检测不到胚胎，检测结果为阴性，但是血液中ＰＡＧｓ蛋白还是在会
在母牛体内存在及循环一段时间，从而导致ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ检测出现
假阴性现象。基于在本次研究课题中阴性预测值１００％，未出现假
阳性，这一检测指标对牧场的繁殖管理至关重要，繁育人员不会
错误的为已妊娠牛只进行再次配种处理，造成妊娠奶牛流产。
通过Ｂ超与ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ检测方法的比较研究，ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ检
测方法是可靠的、准确的。尤其适用于大型牧场，这对牧场的进
一步标准化，规范化管理，提高生产养殖效益有着不可低估的作
用；相关地区部门也可用此诊断方法，适当收取检测费用，组织
当地牧场采用ＰＡＧ ＥＬＩＳＡ方法开展奶牛早期妊娠诊断，这对提升
当地奶牛养殖技术水平，提高牧场养殖生产效益有很大的促进作
用。
４存在的问题及展望
近年来，应用ＰＡＧ—ＥＬＩＳＡ方法来进行奶牛早期妊娠诊断取
得了很大的进步，但还存在着一些局限性。一是该方法进行奶牛
早期妊娠诊断需要配备相关的检测设备，一般奶牛场无法独立完
成，需要送检相关实验室开展检测。二是对配种２８ ｄ以内奶牛妊
娠诊断的准确性有待进一步提高；三是检测成本费用高，据调
查，国内还未研发相关成熟产品，均采用进口检测试剂盒，检测
成本高，检测费用在４０—５Ｏ元一头。
参考最新放射免疫和酶联免疫等技术的发展趋势，随着检
测技术的不断发展与更新，检测血清中ＰＡＧ的检测方法也将更简
便，检测结果也将更准确，检测成本将会更低廉，检ＮＰＡＧ方法
大范围推广应用，替代直肠检测、黄体酮检测、Ｂ超等传统早期
