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高产糖化酶菌株紫外线诱变育种设计方案

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高产糖化酶菌株紫外线诱变育种设计方案 摘 要： 从土壤及霉变淀粉质材料等样品中分离获得到产糖化酶活性较高的菌株；通过紫外线进行诱变处理，得到性能良好的糖化酶变异菌株。对该菌株进行发酵性能测试，该菌株糖化酶活力与原菌株比较；是否酶活力提高，经过继代培养，证明其性状能稳定遗传。通过正交试验，确定菌株最佳培养温度，最适PH值，最适培养时间。 关 键 词 ：紫外线；糖化酶；诱变；菌种选育；酶活力； 目 录 1.设计背景 1.1糖化酶简介 1.2高产糖化酶菌株的意义 2.设计方案 2.1实验策略 2.2材料与方法 2.2.1培养基设置 2.3获得最佳温度最佳加水比 3.方案实施 3.1从土壤中采样 3.2稀释倒平板法纯化 3.3控制培养条件 3.4紫外诱变剂量确定 3.5菌株遗传稳定性实验 3.6诱变菌株进行发酵培养基优化 3.7 测定糖化酶活力 4.结果与结论 4.1筛选结果 4.2复筛结果 4.3菌种的诱变选育 4.3.1紫外诱变剂量的选择 4.3.2菌种紫外诱变筛选 4.4诱变株，遗传稳定性的检测 4.5优化培养基 4.6培养条件的优化 5.讨论 1. 设 计 背 景

1.1糖化酶简介 1.糖化酶:又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)]它能把淀粉从非还原性未端水介绍a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，是工业上应用最广泛的酶类之一，糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。 1.2高产糖化酶菌株的意义 我国生产糖化酶已有20多年历史，作为葡萄糖生产及发酵工业的重要酶种，其产量占全国酶制剂产量的 60％以上且产销量逐年递增。除了利用糖化酶水解淀粉为葡萄糖而用于制糖业外，现在人们越来越多地开发糖化酶的新型用途，糖化酶在酿酒工业中也有广泛的应用，传统白酒.生产用曲中的微生物是依靠自然界带入的，其糖化力较低，耐酸耐热性都较差。糖化酶作用的PH范围为3．0—5．5，最适作用范围为4．0～4．5，适宜发酵。 作用方式：糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性未端切开a-1.4键处，也能缓慢切开a-1.6。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性未端依次切下葡萄单位，在遇到1.6键分割，先将a-1.6键分割，再将a-1.4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖。 2.设 计 方 案

2.1实验策略 1 明确诱变育种目的：改善菌株特性，提高产量。 2 了解影响菌株发育的主要因素：温度，PH。 3 选取准确的检测手段：淀粉--碘显色反映 4 诱变育种理论步骤：筛选出发菌株--菌悬液制备--诱变处理--中间培养--分离筛选 5 本实验步骤：见(3. 方案实施) 注意：本品随作用的温度升高活力增大，超过65℃又随温度升高而活力急剧下降，本品是最适作用温度是60-62℃。最适作用PH舒值在4.0-4.5左右,使用时最适PH4.0-4.5，淀粉糖和味精生产时应先调PH，后加酶糖化。用酶量随原料、工艺不同而变化，要缩短糖化时间需增加用量。 淀粉质原料必须与酶充分接触，接触面积大，时间长，效果好。间歇糖化要搅拌充分，连续化必须流量均匀。温度需严格控制60℃-62℃，保温时温度均匀，严禁短期高温。 酶活力定义： 1克酶粉或1毫升酶液在40℃，PH4.6条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖的酶 量为1个酶活力单位（U）. 2.2材料与方法 1材料 土壤及霉变淀粉质等样品(采集于面粉厂外土壤)。 (1) 培养基 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。 增殖培养基：可溶性淀粉2％，NaNO3 0．3％，K2HPO4 0．1％，MgSO4.7H20 0．05％、KC10．05％，FeSO4 ·7 H20 0．001％，PH 5．5～PH6．0。 选择性培养基：木薯淀粉. 2％，NaNO30．3％，K2HPO4 0．1％，MgSO4·7H20 0．05％，KC1 0．05％，FeSO4·7H20 0．001％，青霉素2ooU／mL，丁卡20μg／mL，琼脂2％，PH5．5-PH6．0。 筛选培养基：玉米粉4％，豆粉3％、麸皮1％， KH2PO4 0．1％，MgSO4·7H20 0．05％，KCl 0．05％，FeSO4 7H20 0．001％。 分离培养培养基：可溶性淀粉8％、NaNO3 0．3％，K2HPO4.3H20 0．1％，FeSO4·7H20 0．0005％，MgSO4·7H20 0．05％，琼脂.. 2％，刚果红0．4％，PH自然。 产酶鉴定培养基：可溶性淀粉2．5％，琼脂2％，刚果红4．0mL，PH6．0，0．1mPa。 菌种保藏培养基：玉米粉5％，豆粕粉3％，麸皮1％，NaNO3 0．4％，MgSO4·7H20 0．05％，ZnSO4 0．05％，KH2PO40．1％，琼脂2．5％。 A：玉米粉2％，豆粉1．5％，麸皮5％，KH2PO4 0．05％，MgSO4·7H20 0．025％，KC1 0．025％。 B：玉米粉0．5％，豆粉0．5％，麸皮4％，KHPO4 0．02％，Mgso4·7H20 0．O1％，KC1 0．O1％。 C：玉米粉0．5％，豆粉0．3％，麸皮4％，KHPO4 0．02％，MgSo4.7H2O 0.01％，NaNO3．ZnSO4.7H20 0．O1％。 D：可溶性淀粉0．2％，葡萄糖0．5％，麸皮4％，蛋白胨0．2％，KH2PO4 0．02％，MgSO4·7 H20 0．01％，KC10．O1％。 2方法

从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称

为微生物的分离纯化。平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。分离得到的单个菌落还要进行性能的筛选,分为初选和复选. 出发菌株筛选 采样一增殖培养（材料预处理）(以可溶性淀粉为唯一碳源)一初筛(平板分离培养)(以生淀粉为唯一碳源，进行富集液体培养)（选出能水解淀粉的菌株）一复筛一摇瓶筛选一菌株一纯化一同步培养，制备单胞悬液。 3. 方 案 实 施

3.1.从土壤中采样 从土壤中分离到所需的菌株，一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品 3.2.稀释倒平板法纯化 : 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 、 1 ∶ 10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 斜面培养：在活化菌种时使用的培养方法里，一般使用固体培养基经过高温灭菌后，以5°左右的斜角，试管口向上放置至培养基冷却凝固，从而形成比正常置试管而更大的固体培养基面积，以方便接种菌种的活化生长。该试管里的呈5°斜角的培养基表面亦被成为斜面，该培养方法被成为斜面培养。 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。 初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株 3.3控制培养条件 在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培养基的pH值调节到

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紫外线诱变育种综述

紫外线诱变育种综述

紫外线诱变育种摘要：紫外线诱变操作简单、对实验设备要求低，是目前被广泛运用的一种物理诱变剂，人们利用紫外线诱变得到了大量的优秀菌种。

本文论述了紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围及研究进展。

关键词：紫外线诱变育种微生物目前微生物发酵技术被广泛的应用到许多生产行业，如生产啤酒、白酒、乳制品、酶制剂、抗生素等行业，同时微生物在解决人类的粮食能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用[1]。

但就目前被投入工业化使用的工业菌大多在生长周期、培养基、产率等方面不能满足工业生产的需求。

理想的工业菌种必须具备: 遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存等特性。

诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术, 它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌, 人为的使其遗传物质发生变异, 从中选育高产菌株[2]。

紫外线诱变属于一种物理诱变剂，它是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。

紫外线诱变可以用于大量不同的菌种育种中，如芽孢杆菌、链霉菌、镰刀菌等，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌种。

由于紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用［3］。

本文对紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围、研究进展进行了概述。

一、紫外线诱变的原理紫外线属于一种物理诱变剂，它能使被照射的物质的分子或原子中的内层电子提高能级。

主要生化反应：1.DNA链和氢键的断裂 2.DNA分子间（内）的交联 3.嘧啶的水合作用 4.形成胸腺嘧啶二聚体 5.造成碱基对转换 6.修复后造成差错和缺失。

紫外线诱变处理的有效波长为200 - 300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。

DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用[4]，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变[5]，从而引起上述的生化反应。

紫外诱变技术实验报告

紫外诱变技术实验报告

一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。

2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。

3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。

二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。

紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。

三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。

2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。

3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。

四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。

2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。

3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。

4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。

5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。

6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。

7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。

五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。

2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。

运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株

运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株

运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株摘要本文介绍了运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株的方法，并对其进行筛选、鉴定及酶活测定。

通过实验验证，成功选育出一株植酸酶高产菌株，其酶活达到了较高水平。

介绍植酸酶是一种具有解除植物中植酸盐抗营养因子作用的酶。

在动物、人类体内，它能够释放无机磷以提高对磷的利用效率。

因此，植酸酶在生物技术和农业生产中具有极高的价值。

目前，获得植酸酶高产菌株的方法有很多，例如基因工程、长期培养筛选等。

然而，这些方法对设备、时间、技术水平等要求比较高，成本也比较高。

相比之下，运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株更具优势。

紫外诱变是一种传统的微生物术语。

它是指用紫外线辐射处理微生物，产生突变，从而改变微生物的某些性状的过程。

它有着速度快、操作简便、筛选效果显著等优点。

实验材料和方法实验菌株以原繁压菌作为研究对象。

原繁压菌是一种常见的生物菌株，可用于生物技术、医药、环保等领域。

实验中使用的原繁压菌来自于某生物技术公司。

实验设备和试剂实验设备包括无菌工作台、高压灭菌器、紫外线灯、恒温振荡培养箱、分光光度计等。

试剂包括琼脂、LB培养基、植酸盐、硝酸钠、Na2HPO4等。

实验步骤1.取10微升的原繁压菌液放置于琼脂平板上，待其全面涂布后将其放入无菌工作台上恒温培养。

2.取1平板用紫外线灯辐照1分钟，同时对照组以同样方式处理。

3.将受照试验组培养菌悬浮于LB液体培养基中，恒温振荡培养，选取菌株后进行次级发酵。

4.通过过筛试验及酶活测定鉴定所获得的高产菌株。

实验结果及分析经过实验验证，紫外诱变成功激发原繁压菌中某些菌株的植酸酶高产潜力。

在恒温振荡扩大培养的过程中，筛选和鉴定了一类植酸酶高产菌株。

经过次级发酵，该高产菌株平均比对照组酶活测定提高了50%左右，酶活达到了200u/g左右。

本实验成功地运用了紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株。

该方法操作简便，快速，能够筛选出带有目的性的高产菌株。

本实验结果可以为利用微生物生产高附加值产品提供实验参考。

实验二：淀粉酶菌株的诱变与筛选

实验二：淀粉酶菌株的诱变与筛选

实验二：淀粉酶菌株的诱变与筛选指导老师：生命科学学院生物技术摘要：实验目的：了解诱变育种的基本原理以及用诱变育种筛选高产菌种的基本方法。

采用方法：利用紫外线诱变育种，分别对要诱变的菌株进行不同时间的诱变，将在红光的照射下将结果稀释不同倍数，涂到平板上进行暗室培养，48小时后观察，用碘液测酶活力，并计算致死率。

关键词：红光；暗室；紫外线；酶活力；诱变；致死率自然界中分离出的菌株为野生菌株，一般发酵活力很低，所以要经过人工选育等来得到突变株。

突变分为自发突变和诱导突变。

因自发突变的频率较低，所以采用诱导突变。

所谓的诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使突变率大幅度提高。

然后筛选出目的突变菌株，以供生产实践或科学实验用。

诱变可由化学或物理因素引起，紫外线诱变是最简单、最常用的一种。

紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。

DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

1.材料和方法1.1材料1.1.1实验菌株枯草杆菌1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、20w紫外线、超净工作台、培养皿、胶头滴管等实验仪器。

1.2方法1.2.1培养基的配置淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。