糖化酶的研究进展及趋势_武金霞

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20世纪80年代,对于糖化酶的研究发展极快,主要集中于糖化酶菌株的分离及其纯化工作.长期研究证明,糖化酶广泛地分布在微生物中,主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中,同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中.已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种;细菌有3属3种[1]. 真菌产糖化酶组分多型性是常见的,Rhizopus nivenus 和Chalara paradoca[2,3]可分别产生5种和6种活性组分.陈冠军、罗贵民等人[4]采用硫酸铵分级沉淀,DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤等方法,从黑曲霉AS3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶GⅠ、GⅡ、GⅢ,其相对分子质量分别为27000、53000和67000;等电点分别为3.38、3.59和3.52;分子含糖量分别为8.7%、18.3%和13.6%;最适温度均为70℃,实验结果证明,三种同工酶都由一条多肽链组成.相对分子质量小的GⅠ具有完整的催化部位结构,而GⅡ和GⅢ多于GⅠ的那部分肽段,则可能起着稳定活性部位和增强结合底物能力的作用.GⅢ比G Ⅱ多一个约含100个残基的肽段,这个肽段可能是GⅢ能被生淀粉吸附的原因所在.One等[5]利用固相Acarbose 柱从市售糖化酶(A.niger)中分离出六种活性组分,每种活性组分均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖终产物.这六种组分的相对分子质量、沉降系数、化学组成、等电点、酶的动力学及其他性质上各异.但Y a2 suda[6]从Monascus sp.NO.3403中分离出两种组分,电泳和超离心结果证明有同质性、相对分子质量、碳氮含量、・161・自然杂志　25卷3期科技进展最适pH 、最适温度及Km 值都非常接近.管汉成、严自正、张树政[7]发现黑曲霉突变株T -21产生的葡萄糖淀粉酶也具有多型性,经凝胶电泳和酶活力显色得到5条以上具有淀粉酶活力的蛋白质带,并从中分离纯化出能被生淀粉吸附和水解生淀粉的G A Ⅰ和既不被生淀粉吸附又不水解生淀粉的G A Ⅱ.方善康和周凤臻[8]对黑曲霉S4的生淀粉糖化酶进行分离,分离出3个均为酸性糖蛋白的G Ⅰ、G Ⅱ和G Ⅲ.糖化酶的多型性可能由下述原因引起:一是基因调控、转录的方式不同;二是蛋白质合成的修饰作用不同,即结合糖量不同;三是在发酵过程中受到自身蛋白水解酶和糖苷酶的作用,由糖化酶的原始形式衍变成糖化酶的.此外培养基的成分和生长条件也对糖化酶组分多型性有影响.二、提高糖化酶活力的研究 几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力,常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径.谷海先等[9]对黑曲霉AN -149菌进行自然分离、紫外线和NTG 的复合诱变处理,得到了一株高产糖化酶的菌株WG-93,经30L 发酵罐试验,酶活力达29ku/ml (原糖化酶生产发酵水平为12ku/ml ).1993年,李俊刚等[10]对生淀粉糖化菌黑曲霉S -1原生质体采用(λ1=260nm ,λ2=266nm )能量为8m J 的激光直接照射,得到高酶活力的生淀粉糖化酶突变株,比出发株酶活力平均提高37.4%,最高突变株酶活力达到74.5u/ml ,比出发株提高91%.1998年,李俊刚等[11]又以黑曲霉523原生质体为对象,经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变,选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉N L -3,其生淀粉酶活力为156u/ml.王海洪等[12]通过分离和筛选,得到一株分解小麦生淀粉能力较强的黑曲霉,其生淀粉糖化酶活力为171.5u/g ,α-淀粉酶活力为6.347u/g.DNA 重组技术发展以来,有人尝试将糖化酶基因克隆到埃希大肠杆菌和酵母菌中,构建了糖化酶高产工程菌.近几年来,罗进贤等人[13]将酵母T y 转座子的δ序列,黑曲霉糖化酶cDNA 及G 418抗性基因neo 重组进酵母整和型质粒Y iplac128获得含LEU2,neo 双标记基因,糖化酶cDNA 的高整和型表达载体Y I128D.17N ,转化CRF18(Y I128D.17N )糖化酶基因在该菌株获得高效表达,产物分泌到胞外.吴晓萍等人[14]将切除了5’端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶G A ⅠcDNA 与大麦α-淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌-酵母穿梭载体,构建重组表达质粒pM AG 11,转化酿酒酵母G RF18,获得含α-淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌G RF18(pM AG 11),在酵母PGK 基因启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达,99%的表达产物分泌至胞外.三、糖化酶的基因的研究 对黑曲霉糖化酶基因的研究有了不断的进展,尤其是对其结构基因和调控序列.Boel 等[15]首先从黑曲霉的染色体文库中分离出糖化酶的基因,它含有五个内含子,而泡盛曲霉中含有四个内含子.两种微生物都分泌糖化酶G A Ⅰ、G A Ⅱ,两种酶都由单一基因编码,有相类似的氨基末端氨基酸序列,在一级结构和C -端序列长度上稍有不同.唐国敏等克隆了突变株T 21的糖化酶cDNA ,并进行了测序[16],实现了糖化酶基因在酿酒酵母中的表达[17],并将糖化酶基因整合到酿酒酵母的基因组内,实现稳定表达[18],克隆并测定了糖化酶基因启动子区的功能[19],该课题组[20]在1996年以PCR 合成的糖化酶高产菌株黑曲霉T 21糖化酶基因5’近端非编码区588bp (Eco -BamHI )的序列为探针,从T 21染色体DNA 中克隆到近2.0kb 的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针,从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T 21的诱变出发株)的染色体DNA 中克隆到1.5kb 的糖化酶基因5’端非编码区序列,并从该二序列的分析测定中得到,黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区被称为“核心启动子”(core prom oter )的T AT AAAT 框及G CAAT 框,分别在翻译起始点的-109bp 及-178bp 处,高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化.在1998年[21]又对糖化酶高产菌株A.niger T 21和原始菌株Aniger 3.795的glaA5’上游区的序列进行了分析,证明两者在1.5kb 的区域内有九个部位的碱基不同.构建了以T 21和3.795glaA 基因转录调控区及A.nidulans trpC 基因终止子为表达元件的E.colihph 基因表达载体(pXH2和p G H1),用pXH2和p G H1分别转化A.niger T 21,对两种转化子的Hm B 抗性水平测定和S outhern 杂交分析显示,在转化子XH2C 和G H1C 中,pXH2和p G H1以相同拷贝数(2拷贝串联)整合到染色体DNA 的相同位置上,XH2C 的Hm B 抗性水平(3000μg/ml )为G H1C (1500μg/ml )的2倍.诱变引起的调控区序列改变使T 21黑曲霉糖化酶基因转录调控区的功能水平比3.795提高1倍.国内对糖化酶研究较多的还有关海山等人[22-24],主要研究不同真菌中糖化酶的基因克隆、表达和糖化酶的性质,在挖掘糖化酶资源方面做了大量工作.・261・Ziran Zazhi V ol.25N o.3科技进展四、扩大糖化酶的应用研究 糖化酶是工业上应用最广泛的酶类之一.除了利用糖化酶水解淀粉为葡萄糖而用于制糖业外,现在人们越来越多地开发糖化酶的新型用途.糖化酶在酿酒工业中也有广泛的应用.传统白酒[24]生产用曲中的微生物是依靠自然界带入的,未经筛选,其糖化力较低,耐酸耐热性都较差.糖化酶作用的pH 范围为3.0～5.5,最适作用范围为4.0～4.5,这使得白酒酿造过程中酸度不断增加,适宜发酵.糖化酶的应用,使粮醅入酵后发酵升温快,升温幅度大,提高原料的出酒率,缩短发酵周期,降低生产成本.在食用醋[25]生产中,应用TH -AATY 和糖化酶,可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题,使食用醋生产正常进行,它不仅降低了原材料的消耗,减轻了工人的劳动强度,而且显著提高了淀粉利用率和出醋率,得到较好的经济效益.固定化糖化酶应用于糖结晶过程,可以提高糖的出产率[26].今后糖化酶将会被应用于更为广阔的空间.五、糖化酶研究的展望 虽然对糖化酶的研究已有多年,但是仍有许多问题尚待进一步探索[27].基础研究领域将主要集中在糖化酶的结构研究,如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用,进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制.应用研究之一仍将是进一步提高糖化酶的活力,利用诱变、DNA 重组技术或其他方法获得优良菌株,提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等,进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件;另一方面,诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因,将是一个重要方向,因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗,从而降低生产成本,将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景.(2002年10月20日收到)武金霞　在职博士生,副教授,河北大学生命科学学院生物技术系,071002王　沛　河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生李晓明　河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生1　陈启和,何国庆.糖化酶及其基因研究进展.微生物学杂志,2000;20(4):462502　Saha C.,Ueda S.J.Ferment Technology ,1983;61:672723　Ishigam i H.,Hashim oto H.,K ainuma K.Starch Sci.,1985;32:19722054　陈冠军,罗贵民,程玉华.黑曲霉糖化酶的分离纯化及其性质.微生物学报,1991;31(3):21322205　One K.,Shigeta S.,Oka S.Agric Biol Chem.,1988;52:1689216966　Y asuda M.,K uwar M.,M atsushita H.Agric Biol Chem.,1989;53:24722567　管汉成,严自正,张树政.黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀粉酶的提纯及其一般性质.生物化学与生物物理学报,1993;25(5):45324598　方善康,周凤臻.黑曲霉S4生淀粉糖化酶的分离纯化及其特性.微生物学报,1993;33(2):10821149　谷海先,张定玲,曹钰.高活力糖化酶菌种选育及发酵研究.食品与发酵工业,1998;24(5):3123610　李俊刚,方善康.激光诱变黑曲霉原生质体选育高酶活生淀粉糖化菌的研究.微生物学通报,1993;20(4):213221511　李俊刚,方善康.生淀粉糖化菌N L 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