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实验六人参中人参皂苷的提取分离及鉴定人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的干燥根，是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著《神农本草经》。
其栽培者称为“园参”，野生者称为“山参”。
人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等的治疗。
人参的化学成分很复杂，有皂苷、挥发油、糖类及维生素等。
经现代医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分，它具有人参的主要生理活性。
人参的根、茎、叶、花及果实中均含有多种人参皂苷(ginsenosides)。
到目前为止，文献报道从人参根及其它部位已分离确定化学结构的人参皂苷有人参皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2 、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3 等50余种人参皂苷。
根据皂苷元的结构可分为A、B、C三种类型：①人参二醇型-A 型，②人参三醇型-B型，③齐墩果酸型-C型。
A型和B型皂苷均属四环三萜皂苷，其皂苷元为达马烷型四环三萜，A型皂甙元称为20(S)-原人参二醇[20（S）-protopanaxadiol]。
B型皂甙元称为20(S)-原人参三醇[20（S）-protopanaxatriol]。
C型皂苷则是齐墩果烷型五环三萜的衍生物，其皂苷元是齐墩果酸(oleanolic acid)。
[目的要求]1.通过实验进一步掌握三萜类化合物的理化性质及提取、分离和检识方法。
2.学习和掌握简单回流提取法、两相溶剂萃取法、旋转蒸发器、大孔树脂柱色谱等基本实验操作技能。
[实验原理]人参的主要成分为人参皂苷，总皂苷含量约4％，人参皂苷大多数是白色无定形粉末或无色结晶，味微甘苦，具有吸湿性。
人参皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙酯，不溶于乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。
实验六⼈参中⼈参皂苷的提取分离及鉴定实验六⼈参中⼈参皂苷的提取分离及鉴定⼈参为五加科植物⼈参(Panax ginseng C.A.Mey.)的⼲燥根，是传统名贵中药，始载于我国第⼀部本草专著《神农本草经》。
其栽培者称为“园参”，野⽣者称为“⼭参”。
⼈参具有⼤补元⽓、复脉固脱、补脾益肺、⽣津、安神之功能，⽤于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚⾷少、肺虚喘咳、津伤⼝渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、⼼⼒衰竭、⼼源性休克等的治疗。
⼈参的化学成分很复杂，有皂苷、挥发油、糖类及维⽣素等。
经现代医学和药理研究证明，⼈参皂苷为⼈参的主要有效成分，它具有⼈参的主要⽣理活性。
⼈参的根、茎、叶、花及果实中均含有多种⼈参皂苷(ginsenosides)。
到⽬前为⽌，⽂献报道从⼈参根及其它部位已分离确定化学结构的⼈参皂苷有⼈参皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2 、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3 等50余种⼈参皂苷。
根据皂苷元的结构可分为A、B、C三种类型：①⼈参⼆醇型-A 型，②⼈参三醇型-B型，③齐墩果酸型-C型。
A型和B型皂苷均属四环三萜皂苷，其皂苷元为达马烷型四环三萜，A型皂甙元称为20(S)-原⼈参⼆醇[20（S）-protopanaxadiol]。
B型皂甙元称为20(S)-原⼈参三醇[20（S）-protopanaxatriol]。
C型皂苷则是齐墩果烷型五环三萜的衍⽣物，其皂苷元是齐墩果酸(oleanolic acid)。
[⽬的要求]1.通过实验进⼀步掌握三萜类化合物的理化性质及提取、分离和检识⽅法。
2.学习和掌握简单回流提取法、两相溶剂萃取法、旋转蒸发器、⼤孔树脂柱⾊谱等基本实验操作技能。
[实验原理]⼈参的主要成分为⼈参皂苷，总皂苷含量约4％，⼈参皂苷⼤多数是⽩⾊⽆定形粉末或⽆⾊结晶，味微⽢苦，具有吸湿性。
⼈参皂苷易溶于⽔，甲醇、⼄醇，可溶于正丁醇、⼄酸、⼄酸⼄酯，不溶于⼄醚、苯等亲脂性有机溶剂。
V o l.32高等学校化学学报N o.1 2011年1月 C H E M I C A LJ O U R N A LO FC H I N E S EU N I V E R S I T I E S 67～73微生物酶催化制备人参皂苷20(S)-R g2,20(S)-R h1和20(S)-P P T成乐琴1,金瑜真2,梁德春2(1.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林132022;2.K o r e a nG i n s e n g C e n t e r f o r M o s t V a l u a b l e P r o d u c t s＆G i n s e n g G e n e t i c R e s o u r c e B a n k,K y u n g H e e U n i v e r s i t y,S u w o n449-701,K o r e a)摘要 以微生物M i c r o b a c t e r i u m e s t e r a r o m a t i c u m G S514的培养液中分离的粗酶为催化剂水解人参皂苷R e和R g1,并通过1HN M R和13CN M R谱对水解产物的结构进行了表征.实验结果表明,反应体系中无机盐N a C l 的存在与否直接影响人参皂苷R e,R g1与粗酶液的反应结果.人参皂苷与粗酶液直接反应时,人参皂苷R e 不发生反应,人参皂苷R g1通过C6所连β-D-吡喃葡萄糖的选择性水解转化成人参皂苷F1.而该反应在无机盐N a C l存在下进行时,人参皂苷R e通过对C20所连β-D-吡喃葡萄糖的选择性水解定向转化为20(S)-人参皂苷R g2;人参皂苷R g1定向转化成20(S)-人参皂苷R h1以及20(S)-原人参三醇(P P T).表明N a C l的加入激活了C20β-D-吡喃葡萄糖苷酶的活性,这对定向合成不同次级人参皂苷具有重要意义.关键词 酶催化制备;20(S)-人参皂苷R g2;20(S)-人参皂苷R h1;20(S)-原人参三醇中图分类号 O629.9;Q559.2 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2011)01-0067-07人参皂苷是人参最主要的药理活性成分.近年来的研究表明,人参次级皂苷具有更强的药理活性和更高的肌体吸收能力.例如人参皂苷在体内被肠道微生物分解成C o m p o u n d K(C-K)吸收[1];人参皂苷R g3,R h2,R h1和C-K均显示出良好的抗癌及抗癌转移作用[2～5],人参皂苷R g3与化疗药物共同使用可提高机体免疫力、延长寿命并提高人的生存质量[6];人参皂苷R g2对心肌缺血有明显的改善作用[7],并对老年痴呆症具有良好的治疗效果[8];20(S)-原人参二醇是少数对野生型和突变型C F T R氯离子通道都具有激活作用的天然化合物之一[9].由于次级人参皂苷在人参中的含量非常低或不存在,因此利用人参中含量较高的主要人参皂苷为原料,通过糖苷键的选择性水解制备次级皂苷越来越受到人们的重视.R g3,R g2,R h2和R h1等次级人参皂苷均存在C20差向异构体,用传统的酸催化水解法水解人参皂苷很难得到单一的异构体,往往得到两种异构体的混合物[10,11],立体选择性较差.酶催化可以有效解决区域选择性和立体选择性问题,但由于人参皂苷的结构特点,用酶催化法通过人参皂苷C20糖苷键的选择性水解制备次级皂苷较为困难[12].前文[13]通过大量的筛选,以人参土壤微生物M i c r o b a c t e r i u me s t e r a r o m a t i c u mG S514有效地将原人参二醇组皂苷R b1和R d通过人参皂苷C20糖苷键的选择性水解转化为20(S)-R g3.酶具有底物特异性,只对特定的底物或相似的底物具有催化活性.原人参二醇组皂苷和原人参三醇组皂苷虽然在糖和糖苷配基的连接位置有所不同,但两者的C20结构相近,为了考察该微生物酶对原人参三醇组皂苷的C20糖苷键的水解能力,本文利用从上述微生物中分离的粗酶作用于人参皂苷R e和R g1进行皂苷的选择性水解,并通过1H N M R和13CN M R确定了所生成的次级皂苷的结构.人参皂苷R e和R g1分解成皂苷元的过程见图1.收稿日期:2010-04-06.基金项目:韩国科技部21世纪前沿研发计划植物多样性研究中心(批准号:P F06222-00)资助.联系人简介:梁德春,男,博士,教授,主要从事人参皂苷研究.E-m a i l:d c y a n g@k h u.a c.k rF i g .1 B i o t r a n s f o r m a t i o np a t h w a yo f g i n s e n o s i d e R e a n dR g 11 实验部分1.1 试剂与仪器人参皂苷R e ,R g 1以及人参皂苷对照品R b 1,R b 2,R c ,R d 和R h 1由韩国K T ＆G 中央研究院提供;人参叶总皂苷(吉林辉南宏久生物科技股份有限公司);L B 肉汤(美国D i f c o 公司);T L C 薄层板采用60F -254硅胶板(德国M e r c k 公司);M i c r o b a c t e r i u me s t e r a r o m a t i c u mG S 514菌种分离自人参土壤[13].V a r i a n -I n o v a A S 400F T N M R 核磁共振仪(美国V a r i a n 公司);N S 3000i 高压液相色谱(韩国F u t e c s有限责任公司);J E O LJ M S A X 505-W A 质谱仪(日本J E O L 公司).1.2 实验过程1.2.1 菌种的培养 将0.5g L B 肉汤用20m L 蒸馏水溶解,在121℃下灭菌15m i n ,冷却,接入活化好的G S 514菌种,于25℃、160r /m i n 条件下培养至O D 600值为0.5～0.8.在发酵液中加入浓度为10m g /m L 用0.45μm 微孔滤膜过滤的人参叶皂苷溶液0.6m L 作为诱导物,在相同条件下继续培养24h .1.2.2 酶液的制备及蛋白质浓度测定 将培养液在4℃、12000r /m i n 下离心40m i n ,除去菌体,将上清液用3倍体积的丙酮溶液沉淀蛋白质,用等体积的20m o l /LN a H 2P O 4/N a 2H P O 4缓冲溶液溶解作为粗酶.粗酶液中蛋白质浓度按照B r a d f o r d 方法[14]测定.1.2.3 人参皂苷R e 和R g 1的转化 在浓度为0.001m o l /L 人参皂苷R e 和0.0012m o l /L 人参皂苷R g 1的5%丙酮水溶液中,加入等体积的浓度为0.18μg /m L 的粗酶溶液,于30℃、160r /m i n 摇床反应48h .每隔6h 用水饱和正丁醇提取反应液,在40℃下用旋转蒸发仪浓缩,将残留物溶于H P L C 级甲醇中,进行薄层色谱(T L C )和高效液相色谱(H P L C )分析.另取浓度为0.001m o l /L 的人参皂苷R e 和0.0012m o l /L 的人参皂苷R g 1的5%丙酮水溶液,加入等体积的粗酶溶液,同时加入浓度为5m o l /L 的N a C l 溶液至最终浓度为5g /L ,使上述反应可在与L B 肉汤发酵液反应时相同的盐浓度下进行.1.2.4 T L C 分析 用微量点样器将人参皂苷对照品与反应产物点样于T L C 板上,用C H C l 3/C H 3O H /H 2O (体积比为65∶35∶10,下层)混合溶剂展开5.5c m ,吹干后喷10%H 2S O 4水溶液,于110℃加热显色.1.2.5 H P L C 分析 采用C 18色谱柱(250m m×4.6m mi .d .,5μm );流动相A :乙腈,流动相B :水.梯度洗脱:0～5m i n ,15%A ,85%B ;5～25m i n ,15%～21%A ,85%～79%B ;25～70m i n ,21%～58%A ,79%～42%B ;70～72m i n ,58%～90%A ,42%～10%B ;72～82m i n ,90%A ,10%B ;82～84m i n ,90%～15%A ,10%～85%B ;84～100m i n ,15%A ,85%B ;流速1.6m L /m i n ;检测波长203n m .1.2.6 结构表征 将人参皂苷R e 和R g 1的转化产物1～4进行分离,以吡啶为溶剂,通过1H N M R 和13CN M R 对其结构进行表征.次级皂苷1:白色粉末,产率51.7%(反应48h ),m .p .196～199℃.F A B -M S ,m /z :785[M +1]+.1H N M R (P y r i d i n e -d 5,400MH z ),δ:0.94,0.95,1.18,1.34,1.38,1.62,1.67,2.11(a l l 3H ,68高等学校化学学报 V o l .32 s ,8M e ),1.78(3H ,d ,J =6.0H z ,r h a -M e ),3.47(1H ,d d ,J =4.8,11.0H z ,H -3α),3.90(1H ,t ,J =9.2H z ,H -12α),4.67(1H ,d d ,J =3.2,9.2H z ,H -6β),5.26(1H ,d ,J =6.4H z ,H -6-g l c -1H ′),5.33(1H ,t ,J =6.4H z ,H -24),6.49(1H ,b r s ,H -6-r h a -1H ′′).次级皂苷2:淡黄色粉末,产率59.3%(反应48h ),m .p .169～172℃.F A B -M S ,m /z :639[M+1]+.1HN M R (P y r i d i n e -d 5,400M H z ),δ:0.96,1.00,1.08,1.44,1.61,1.97(a l l 3H ,s ,6M e ),1.58(6H ,s ,2M e ),3.51(1H ,d d ,J =4.8,11.2H z ,H -3α),3.92(1H ,o v e r l a p p e d ,H -12α),4.39(1H ,d t ,J =3.2,10.0H z ,H -6β),5.18(1H ,d ,J =8.0H z ,H -20-g l c -1H ′),5.24(1H ,t ,J =6.4H z ,H -24).次级皂苷3:淡黄色粉末,产率18.6%(反应24h ),m .p .253～255℃.F A B -M S ,m /z :639[M+1]+.1H N M R (P y r i d i n e -d 5,400MH z ),δ:0.81,1.02,1.18,1.39,1.60,1.62,1.65,2.08(a l l 3H ,s ,8M e ),3.52(1H ,d d ,J =4.4,11.6H z ,H -3α),3.94(1H ,o v e r l a p p e d ,H -12α),4.53(1H ,d d ,J =2.8,10.0H z ,H -6β),5.04(1H ,d ,J =7.6H z ,H -6-g l c -1H ′),5.32(1H ,t ,J =6.4H z ,H -24).次级皂苷4:淡黄色粉末,产率91.7%(反应48h ),m .p .165～167℃.F A B -M S ,m /z :477[M+1]+.1H N M R (P y r i d i n e -d 5,400MH z ),δ:0.96,1.00,1.10,1.41,1.44,1.62,1.65,1.98(a l l 3H ,s ,8M e ),3.52(1H ,d d ,J =4.8,11.2H z ,H -3α),3.93(1H ,d d d -l i k e ,H -12α),4.40(1H ,d t ,J =3.6,10.0H z ,H -6β),5.33(1H ,t ,J =7.2H z ,H -24).转化产物1—4的13CN M R 数据见表1.T a b l e 1 13C N MR (100MH z ,p y r i d i n e -d 5)da t ao f t h e m e t ab o l i t e s 1—4C a r b o ns i t eδ1234C a r b o ns i t e δ1234C 139.539.5＊39.539.5＊C 2717.017.917.517.8C 227.928.327.928.3C 2832.332.131.832.1C 378.678.578.678.5C 2917.7＊16.716.516.6C 440.140.440.940.5C 3017.317.716.917.2C 560.961.861.561.9S u g e r m o i e t y C 674.367.878.267.86-G l cC 746.247.645.347.61101.8106.1C 841.241.341.241.3279.575.6C 949.845.050.350.2378.379.7C 1039.739.5＊39.839.5＊472.671.9C 1132.231.032.232.2578.480.1C 1271.170.271.171.1663.263.2C 1348.349.248.448.36-R h a C 1451.851.451.751.71102.0C 1531.430.931.431.5272.3C 1626.926.827.227.0372.5C 1754.851.754.954.9474.2C 1817.817.617.8＊17.7569.5C 1917.7＊17.517.8＊17.6618.0C 2073.083.373.073.020-G l c C 2127.222.527.027.2198.3C 2235.936.235.936.0275.2C 2323.123.323.223.1379.4C 24126.3125.9126.3126.3471.7C 25130.7130.9130.7130.8578.3C 2626.025.925.926.0663.0 ＊O v e r l a p p e dw i t h o t h e r s i g n a l s .2 结果与讨论2.1 粗酶与人参皂苷R e 的反应前期研究[13]已经证实人参土壤微生物M i c r o b a c t e r i u me s t e r a r o m a t i c u mG S 514的L B 肉汤发酵液可将69 No .1 成乐琴等:微生物酶催化制备人参皂苷20(S )-R g 2,20(S )-R h 1和20(S )-P P T原人参二醇组皂苷R b 1和R d 转化为稀有人参皂苷20(S )-R g 3,说明该微生物可以产生水解原人参二醇组皂苷的C 20位糖苷键的β-葡萄糖苷酶.原人参三醇组皂苷与原人参二醇组皂苷在C 20位的结构很相近.为了考察该β-葡萄糖苷酶对原人参三醇组皂苷的C 20位糖苷键的选择性水解催化活性,将人参土壤微生物M i c r o b a c t e r i u me s t e r a r o m a t i c u mG S 514的L B 肉汤发酵液经有机溶剂沉淀法制成粗酶,分别与原人参三醇组皂苷R g 1和R e 进行反应,期望得到具有良好药理活性的次级人参皂苷R h 1和R g 2(见图1).图2(A )的T L C 分析结果表明,当人参皂苷R e 与粗酶液直接进行反应时,未发生预想的人参皂苷的转化.但在反应体系中加入少量N a C l 时,随着反应时间的增加,部分人参皂苷R e 逐渐发生分解,并生成与对照品人参皂苷R g 2具有相同R f值的次级人参皂苷1[图2(B )].F i g .2 T L Ca n a l y s i s o f h y d r o l y z a t e s o f g i n s e n o s i d e R e c o n v e r t e db y c r u d e e n z y m e p r e p a r e df r o m G S 514w i t h o u t (A )a n dw i t h (B )N a C l对人参皂苷R e 与粗酶液反应24h 的产物进行了H P L C 分析,其结果与T L C 分析结果完全相符.如图3(A )所示,当粗酶液与人参皂苷直接反应时,产物的H P L C 谱图中出现两组吸收峰.其中,保留时间为20.4m i n 处出现的吸收峰归属于原料人参皂苷R e ,保留时间为52.5m i n 处出现的吸收峰经过粗酶液的H P L C 分析,证实为粗酶液中的未知成分,说明原料皂苷并未发生任何水解.相反,在反应体系中加入N a C l [图3(B )]后,除了出现人参皂苷R e 吸收峰外,在保留时间38.0m i n 处出现了新的次级人参皂苷1的吸收峰,它与人参皂苷标准品R g 2具有相同的保留时间,因此推测该吸收峰为人参皂苷R g 2的吸收峰.F i g .3 H P L Ca n a l y s i s o f h y d r o l y z a t e s o f g i n s e n o s i d e R e c o n v e r t e db yc r u d e e n z y me p r e p a r e df r o mG S 514w i t h o u t (A )a n dw i t h (B )N a C l2.2 粗酶与人参皂苷R g 1的反应采用同样的方法将人参皂苷R g 1与粗酶液进行反应.结果表明,反应体系中是否存在N a C l 同样获得不同的水解效果.如图4(A )所示,当人参皂苷R g 1与粗酶液直接进行反应时,可以将R g 1转化为比人参皂苷R h 1的R f值略高的次级人参皂苷2,并未生成C 20位葡萄糖的水解产物R h 1.相反,在反应体系中加入N a C l 后,用粗酶液催化水解人参皂苷R g 1则生成了与对照品人参皂苷70高等学校化学学报 V o l .32 R h 1具有相同R f 值的次级皂苷3和4[图4(B )].次级皂苷3的浓度随着反应时间的延长先增大后减小,而次级皂苷4的浓度则逐渐增大,由此可知,人参皂苷R g 1首先转化成次级皂苷3,继而转化成次级皂苷4.F i g .4 T L C a n a l y s i s o f h y d r o l y z a t e s o f g i n s e n o s i d e R g 1c o n v e r t e db yc r u d e e n z y me p r e p a r e df r o mG S 514w i t h o u t (A )a n dw i t h (B )N a C l人参皂苷R g 1与粗酶液反应24h 的反应产物H P L C 分析结果见图5.在粗酶液与人参皂苷R g 1反应的H P L C 谱图[图5(A )]中,在保留时间20.1m i n 处出现了原料人参皂苷R g 1的吸收峰,41.7m i n 处出现了未知次级皂苷2的吸收峰;而N a C l 存在下粗酶液与人参皂苷R g 1反应的H P L C 谱图[图5(B )]中,在保留时间37.9m i n 处出现了次级皂苷3的吸收峰,保留时间55.1m i n 处出现了未知次级皂苷4的吸收峰,在保留时间41.7m i n 处观察到非常弱的次级皂苷2的吸收峰,其中保留时间37.9m i n 出现的吸收峰与人参皂苷标准品R h 1的保留时间相符,推测该吸收峰为人参皂苷R h 1的吸收峰.F i g .5 H P L C a n a l y s i s o f h y d r o l y z a t e s o f g i n s e n o s i d e R g 1c o n v e r t e db y c r u d e e n z y m e p r e p a r e df r o mG S 514w i t h o u t (A )a n dw i t h (B )N a C l由人参皂苷R e ,R g 1与M i c r o b a c t e r i u me s t e r a r o m a t i c u mG S 514的粗酶液反应可知,只有在N a C l 存在下,R e 和R g 1的C 20位糖苷键才能被水解,即该β-葡萄糖苷酶因N a C l 的加入而被激活.为了进一步考察该葡萄糖苷酶对金属离子的依赖性,分别加入K C l ,M g C l 2,C a C l 2,C o C l 2,F e C l 3,K I ,K N O 3,K 2S O 4和N a 2C O 3等无机盐进行反应.实验结果表明,加入钾盐和镁盐(除了N a 2C O 3因碱性过大导致酶活性消失)时,与加入N a C l 一样显示出了良好的酶催化活性(数据未公开).在钾盐、钠盐和镁盐中显示出的良好酶活性进一步说明该酶可被K +,N a +和M g 2+等典型的金属离子激活.另外,比较图5(A )和(B )可见,次级皂苷2的含量明显降低,说明N a C l 的加入使另外一些糖苷酶的活性显著降低.2.3 结构表征由图1可知,人参皂苷R e 和R g 1通过糖苷键的水解可以得到R g 2,F 1,R h 1和P P T 等次级皂苷,其中R g 2,R h 1和P P T 均存在C 20差向异构体,通过T L C 和H P L C 分析很难区分.为了确证次级人参皂苷的立体结构,对人参皂苷R e 和R g 1的转化产物1～4进行了分离,并通过1HN M R 和13C N M R 进行了结构表征.在次级人参皂苷1的1HN M R 中,在δ0.94(3H ,s ),0.95(3H ,s ),1.18(3H ,s ),1.34(3H ,s ),71 No .1 成乐琴等:微生物酶催化制备人参皂苷20(S )-R g 2,20(S )-R h 1和20(S )-P P T72高等学校化学学报 V o l.32 1.38(3H,s),1.62(3H,s),1.67(3H,s)和2.11(3H,s)处出现的8个单峰是8个角甲基的信号峰,在δ1.78处出现的双峰是鼠李糖(R h a m n o s e)的甲基吸收峰,在δ5.33处出现的三重峰是与C24相连的质子信号峰,而在δ5.26处出现的双峰和δ6.49处出现的单峰分别是葡萄糖和鼠李糖端基的质子信号峰.采用1HN M R对人参皂苷中C20位差向异构体进行区分较为困难,但在13CN M R中,通过与C20手性碳原子相连的C17,C21和C22的碳核磁共振信号位置可以方便地区分两种异构体.次级皂苷1的13C N M R谱共给出了42个碳吸收峰.在δ126.3和130.7处出现了C24和C25不饱和碳原子的核磁共振吸收峰,δ101.8和102.0处出现了葡萄糖和鼠李糖的端基碳原子吸收峰.结合C20化学位移由人参皂苷R e[15]中的δ83.2显著地向高场移动至δ73.0可知,与C20相连的β-D-吡喃葡萄糖被水解,同时C17,C21和C22的化学位移分别出现在δ54.8,27.2和35.9处,与20(S)-R g2的碳核磁共振信号完全吻合[16],由此可以确认人参次级皂苷1为20(S)-人参皂苷R g2.同理,次级皂苷3和4的核磁共振数据与20(S)-人参皂苷R h1[16]及20(S)-P P T[17]的文献值完全相符,分别鉴定为20(S)-人参皂苷R h1和20(S)-P P T.次级皂苷2是人参皂苷R g1的水解产物,在其1HN M R中,δ0.96 (3H,s),1.00(3H,s),1.08(3H,s),1.44(3H,s),1.58(6H,s),1.61(3H,s),1.97(3H,s)处出现的7个单峰是8个角甲基的吸收峰,δ5.24处出现的三重峰是与C24相连的质子吸收峰,而δ5.18处出现的双峰是葡萄糖端基质子信号.在次级皂苷2的13CN M R中,δ125.9和130.9处出现了C24和C25不饱和碳原子的核磁共振吸收峰,δ98.3处出现了一个葡萄糖端基碳原子吸收峰.结合C6化学位移由人参皂苷R g1[17]的δ77.8向高场δ67.8移动可知,与C6相连β-D-吡喃葡萄糖被水解,由此可以推断次级皂苷2是人参皂苷F1.人参土壤微生物M i c r o b a c t e r i u m e s t e r a r o m a t i c u mG S514的L B肉汤发酵液(含N a C l)与人参皂苷R b1以及R d反应时,通过酶催化水解C20所连葡萄糖,可获得C20位差向异构体中的20(S)-人参皂苷R g3[13];而当该微生物的培养液中分离的粗酶液直接与人参皂苷R e和R g1反应时,并不能水解C20位葡萄糖,只有无机盐N a C l存在下,才通过水解C20位的葡萄糖苷键得到C20差向异构体中的20 (S)-R g2,20(S)-R h1和20(S)-P P T.说明将原人参二醇组皂苷R b1和R d水解为20(S)-R g3的酶以及将原人参三醇组皂苷R e和R g1水解为20(S)-R g2,20(S)-R h1和20(S)-P P T的酶可能是同一种酶,而且该酶可被N a C l激活,因此很可能是金属依赖性酶.酶催化水解人参皂苷制备次级人参皂苷具有很高的区域选择性和立体选择性.本文利用人参土壤微生物M i c r o b a c t e r i u me s t e r a r o m a t i c u mG S514通过C20位葡萄糖的水解,高选择性地制备了20(S)-R g2, 20(S)-R h1和20(S)-P P T,对于开发相关药物具有重要意义.在实验过程中同时发现,无机盐N a C l的加入可以激活某些酶的活性,但同时使另外一些酶活性显著降低的现象,其原因有待于进一步研究.参 考 文 献[1] A k a o T.,K a n a o k aM.,K o b a s h i K..B i o l.P h a r m.B u l l.[J],1998,21(3):245—249[2] L e eS.Y.,K i m G.T.,R o hS.H.,S o n g J.S.,K i mH.J.,H o n g S.S.,K w o n S.W.,P a r kJ.H..B i o s c i.B i o t e c h n o l.B i o c h e m.[J],2009,73(4):811—816[3] P a r k M.T.,C h a H.J.,J e o n g J.W.,L e e H.Y.,K i mS.I.,B a c kN.I.,K i mO.H.,K i mK.W..J.G i n s e n g R e s.[J],1998,22(3):216—221[4] L e eS.J.,S u n g J.H.,L e eS.J.,M o o n C.K.,L e e B.H..C a n c e r L e t t.[J],1999,144(1):39—43[5] L e eS.J.,K o W.G.,K i mJ.H.,S u n g J.H.,M o o nC.K.,L e e B.H..B i o c h e m.P h a r m a c o l.[J],2000,60(5):677—685[6] X u T.M.,Y i n gX.,C u i M.H.,J i a n g X.,G uL.P..C h i n.M e d.J.[J],2007,120(7):584—588[7] T I A NJ i a n-M i n g(田建明),L I H a o(李浩),Y EJ i n-M e i(叶金梅),G U OWe i-F a n g(郭伟芳),L I L o n g-Y u n(李龙云),W A N GL i-P i n g(王力平).C h i n a J.C h i n.M a t.M e d.(中国中药杂志)[J],2003,28(12):91—92[8] L i N.,L i uB.,D l u z e nD.E.,J i nY..J.E t h n o p h a r m a c o l.[J],2007,111(3):458—463[9] L I UJ u n(刘军),N AWa n-L i(那万里),X I NWe i-H o n g(辛伟红),L I UL i-D a n(刘丽丹),Y U B o(于波),M AT o n g-H u i(麻彤辉),Y A N GH o n g(杨红).C h e m.J.C h i n e s eU n i v e r s i t i e s(高等学校化学学报)[J],2008,29(4):731—735[10] B a e E.A.,H a nM.J.,K i mE.J.,K i mD.H..A r c h.P h a r m.R e s.[J],2004,27(1):61—67[11] H a nB .H .,P a r kM .H .,H a nY .N .,Wo o L .K .,S a n k a w a U .,Y a h a r aS .,T a n a k a O ..P l a n t a M e d .[J ],1982,44:146—149[12] K i mC .S .,C h o i K .J .,K o S .Y .,S u n g H .S .,L e eY .G .,K i mS .C ..J .G i n s e n gR e s .[J ],1998,22(3):205—210[13] C h e n gL .Q .,N a J .R .,B a n g M .H .,K i m M .K .,Y a n g D .C ..P h y t o c h e m .[J ],2008,69(1):218—224[14] B o l l a gM .D .,R o z y c k i D .M .,E d e l s t e i nJ .S ..P r o t e i n M e t h o d s [M ],N e wY o r k :Wi l e y -L i s s ,I n c .,1996:62—67[15] L e i J .,L i X .,G o n gX .J .,Z h e n g Y .N ..M o l e c u l e s [J ],2007,12(9):2140—2150[16] K o S .R .,C h o i K .J .,S u z u k i K .,S u z u k i Y ..C h e m .P h a r m .B u l l .[J ],2003,51(4):404—408[17] M AS h u a n g -G a n g (马双刚),J I A N GY o n g -T a o (姜永涛),S O N GS h a o -J i a n g (宋少江),W A N GZ h e n -H u a (王振华),B A I J i n g (白景),X US u i -X u (徐绥绪),L I UK e (刘珂).A c t a P h a r m a c e u t i c aS i n i c a (药学学报)[J ],2005,40(10):924—930E n z y m e -c a t a l y z e d P r e p a r a t i o no f 20(S )-G i n s e n o s i d e R g 2,20(S )-G i n s e n o s i d e R h 1a n d 20(S )-P P TC H E N GL e -Q i n 1,K I M Y u -J i n 2,Y A N GD e o k -C h u n2＊(1.S c h o o l o f C h e m i c a l a n d P h a r m a c e u t i c a l E n g i n e e r i n g ,J i l i n I n s t i t u t e o f C h e m i c a l T e c h n o l o g y ,J i l i n 132022,C h i n a ;2.K o r e a n G i n s e n gC e n t e r f o r M o s t V a l u a b l e P r o d u c t s ＆G i n s e n g G e n e t i c R e s o u r c e B a n k ,K y u n gH e e U n i v e r s i t y ,S u w o n 449-701,K o r e a )A b s t r a c t T h e p r o s a p o g e n i n s o f g i n s e n o s i d e s h a v e s i g n i f i c a n t p h a m a c o l o g i c a l a c t i v i t i e s s u c h a s a n t i t u m o r a n d a n t i m e t a s t a t i c e f f e c t s .O w i n g t o l o wo r n o n -e x i s t e n t c o n t e n t o f t h e p r o s a p o g e n i n s i n n o r m a l g i n s e n g ,i t i s n e c e s -s a r y a n d m e a n i n g f u l t o p r e p a r e m o r e a c t i v e p r o s a p o g e n i n b y d e g r a d a t i o n o f m a j o r g i n s e n o s i d e s .I n t h i s p a p e r ,g i n s e n o s i d e s R e a n dR g 1w e r e h y d r o l y z e d b y c r u d e e n z y m e o f s t r a i n M i c r o b a c t e r i u m e s t e r a r o m a t i c u m G S 514a n d t h e r e s u l t a n t 's s t r u c t u r e s w e r e d e t e r m i n e db y 1H N M Ra n d 13CN M Ra n a l y s e s .T h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o wt h a t t h er e a c t i o no f g i n s e n o s i d e sR ea n dR g 1w i t hc r u d e e n z y m e si s a f f e c t e db y N a C l t r e a t m e n t .I f g i n s e n o s i d e s R e a n dR g 1r e a c t e dw i t hc r u d e e n z y m e s d i r e c t l y ,g i n s e n o s i d e R ec o u l dn o t b ec o n v e r t e di n t o o t h e r g i n s e n o s i d e s a n dg i n s e n o s i d eR g 1w a s c o n v e r t e di n t og i n s e n o s i d eF 1t h r o u g hs e l e c t i v eh y d r o l y s i so f β-D -g l u c o p y r a n o s y l m o i e t y c o n n e c t e dw i t hC 6.B u t i f t h e r e a c t i o nw a s c a r r i e do u t i n t h e p r e s e n c e o f N a C l ,g i n s e n o s i d e R e c o n v e r t e di n t o 20(S )-g i n s e n o s i d eR g 2,g i n s e n o s i d eR g 1i n t o 20(S )-g i n s e n o s i d e R h 1a n d 20(S )-p r o t o p a n a x a t r i o l t h r o u g h s e l e c t i v e h y d r o l y s i s o f β-D -g l u c o p y r a n o s y l m o i e t y c o n n e c t e d w i t h C 20.T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t C 20β-D -g l u c o p y r a n o s i d e e n z y m e i s a c t i v a t e d b y N a C l ,a n d i t h a s s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e p r o d u c t i o n o f d i f f e r e n t s e c o n d a r y g i n s e n o s i d e s b y h i g h r e g i o s e l e c t i v i t y a n d s t e r e o s e l e c t i v i t y .K e y w o r d s E n z y m e -c a t a l y z e d p r e p a r a t i o n ;20(S )-g i n s e n o s i d e R g 2;20(S )-g i n s e n o s i d e R h 1;20(S )-p r o t o -p a n a x a t r i o l(E d .:H ,J ,K )73 No .1 成乐琴等:微生物酶催化制备人参皂苷20(S )-R g 2,20(S )-R h 1和20(S )-P P T。
