慢病毒包装试剂盒说明书

过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月目录简介 (3)第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4)实验材料 (5)过表达克隆制备 (6)第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17)实验材料 (18)L e n t i v i r u s病毒包装 (21)病毒的收获及浓缩 (22)L e n t i v i r u s滴度测定 (24)参考文献 (33)简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。

吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。

吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。

GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。

通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。

pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。

pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。

第一天：293FT细胞提前铺6孔板，保证第二天汇合度达到90-95％.第二天：1，AB液准备：A：0.5μgPMD2.G+ 1.5μgpsPAX2+ 2μg目的质粒+250μL opit-MEM 混匀。

（先加质粒到EP管，再加培养基）B：10μL lipo2000 + 240μL opit-MEM混匀。

2，静置5min，后将AB液混合均匀，放置30min。

均匀滴加到6孔板。

3，转染6-8h后跟换2mL培养基。

4，48h后收集上清于4℃保存，再添加2mL培养基继续培养24小时。

5，合并两次收集的病毒液上清，3000rpm离心5min，取上清经0.45μm过滤器过滤，病毒液直接感染细胞或-80℃保存。

细胞感染：培养细胞汇合度至50％，病毒上清与培养基1:1感染细胞，加polybrene 终浓度8μ/ML，持续感染至细胞传代。

至少感染48h以上然后加puro筛选或过流式筛选。

不挑取单克隆：将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。

连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株感染悬浮细胞上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（500g-1000g/min）离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。

若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可注意：1，实验细胞状态良好2，培养基用无双抗DMEM3，293FT细胞汇合度90-95％4，根据情况可以进行多次感染如果要感染干细胞，那最后一步293T的收毒加入干细胞培养基。

随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存。

慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于：¾构建Cas9蛋白表达细胞系¾在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004pGR载体系列 CR2011~CR2013pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916Tel：010‐62495135Emai：order@Web site：目录1、产品简介 (2)1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2)1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2)2、Cas9表达慢病毒制备 (3)2.1试剂准备 (3)2.2简要实验流程 (4)2.3实验前准备 (4)2.4病毒制备步骤 (5)2.4 PEG纯化慢病毒 (6)3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7)3.1 试剂 (7)3.2 实验前准备 (7)3.3 筛选细胞系实验步骤 (8)3.4 Cas9表达细胞系检测 (9)4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10)4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10)4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11)5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13)5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13)5.2 靶点设计 (13)5.3 pGR载体构建步骤 (14)附录1 用到的产品 (17)附录2 引物列表 (17)11、产品简介1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。

2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表 达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞 于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打 可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将 所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。