海藻酸裂解酶酶活力检测方法

木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。

2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。

3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。

待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。

4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。

0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。

5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。

冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。

使用前重新确认并调整pH至规定值。

二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。

L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。

以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。

利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。

其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。

2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。

然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。

测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。

一种羧酸酯酶活力的检测方法与流程
一种羧酸酯酶活力的检测方法和流程主要包括以下几个步骤：
第一步：制备样品
从微生物或动植物中提取羧酸酯酶，并将其纯化至一定程度。

可
以采用各种方法提取和纯化酶，如超声波破碎、离心、柱层析等。

第二步：准备反应体系
将提取得到的酶加入含有特定底物的反应体系中，底物通常为p-
硝基苯酯、碱式酯等。

反应体系需要保证酶和底物的浓度和pH值等参
数合适，以确保反应的可靠性和准确性。

第三步：进行反应
将反应体系加热至一定温度，保持一定反应时间。

在反应过程中，底物被酶催化剂水解，产生相应的产物。

反应后，可以通过各种方法
检测产物的生成量，如分光光度法、荧光法、比色法、质谱法等。

第四步：计算酶活力
根据反应产物的生成量计算酶的活力，通常以酶单位（enzymatic unit，U）表示。

酶活力的计算与反应体系的参数、反应时间等有关。

通过以上几个步骤，就可以检测并计算出羧酸酯酶的活力。

这种
方法可以广泛应用于各种生物样品中的酶活力检测，有助于深入了解
各种生物中的基本代谢过程。

酶活测定方法.doc二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。

二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。

在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。

因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。

（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。

（三）试剂1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。

母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。

取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。

2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。

3．50 mmol/L邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。

四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

实验方法李菁华2016.6一叶片相对含水量（RWC）采用烘干称重法测定将叶片称鲜重（Fw）等量两份，然后一份浸入去离子水8h后称其饱和鲜重（Tw），将另一份材料于105℃烘箱中杀青30min，再在80℃下烘干48h至恒重记为干重（Dw），按如下公式计算（Fw-Dw）叶片相对含水量（%）= ×100%（Tw-Dw）邹琦.植物生理学实验指导M .北京：中国农业出版社，2000二根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。

所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

二、试剂1）乙酸乙酯（分析纯）2）连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末，俗称保险粉。

3）0.4%TTC（又名红四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶液：准确称取TTC0.4g，溶于少量水中，定容到100ml。

4）磷酸缓冲液（1/15mol·L-1，pH7.0）:A液：称取纯Na2HPO4·2H2O 11.876g溶于蒸馏水中成1000ml。

B液：称取纯KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中成1000ml。

用时取A液60ml，B液40ml混合即成。

5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸5.5ml，边搅拌边加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，冷却定容至100ml。

三、实验步骤1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml容量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的TTF。

再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。

然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

一种海藻酸钠含量的测定方法一、实验器材和试剂准备1.实验器材：-电子天平-恒温水浴-pH计-分光光度计-紫外可见分光光度计-恒温振荡器2.试剂准备：-海藻酸钠样品-硝酸钠-硫酸钠-盐酸-碱式洗涤剂-无水甲醇-醋酸乙酯-双氧水-酶溶液：包括褐藻酶和过氧化氢酶溶液-还原剂：亚硫酸氢钠溶液-挥发性酸溶液：包括硫酸溶液和硝酸溶液二、实验步骤1.样品前处理将海藻酸钠样品粉碎并通过筛网，以确保样品均匀且没有结块。

2.浸提和清洗将样品加入含有0.1M硝酸钠的恒温水浴中，温度保持在40℃，并用恒温振荡器进行振荡浸提1小时。

然后用蒸馏水清洗样品，使其pH值保持在中性范围。

3.测定多糖含量将浸提后的样品中的多糖含量通过分光光度计进行测定。

以二甲基亚砜为参比溶剂，将样品溶解，并在300-800nm的波长范围内进行扫描。

通过对比样品和空白参比溶剂的吸光度，计算出多糖含量。

4.溶解和酶降解取一定量的样品溶解于水中，并在酶切条件下进行酶降解。

首先加入褐藻酶溶液，将反应温度维持在40℃，并通过恒温振荡器进行振荡。

之后，加入过氧化氢酶溶液，继续振荡反应30分钟。

停止反应后，用亚硫酸氢钠作为还原剂，进行反应停止和去除未反应的酶。

5.测定海藻酸含量通过紫外可见分光光度计测定反应液中海藻酸的含量。

在235nm处测定吸光度，并以海藻酸标准曲线进行校正和计算。

6.验证方法准确性通过添加已知浓度的海藻酸钠溶液进行方法准确性验证。

重复测定多次，并计算平均值和标准偏差。

7.方法精密度在恒温条件下，通过多次测定同一样品的重复性，计算方法的精密度。

8.方法选择性通过重复测定多种样品，包括其他多糖或相关化合物，以评估方法的选择性和干扰物。

9.系统恒定性在一定时间内，通过重复测定相同样品，评估分析系统的稳定性。

三、结果分析通过上述实验步骤测得的数据，可以计算出海藻酸钠的含量。

通过多次实验，计算出平均值和标准偏差，并与标准曲线数据进行比较。

如果平均值和标准偏差在一定范围内，可认为该方法准确、精密和可靠。

测土壤酶活方法酶活性是评价土壤质量和生物活性的重要指标之一。

测定土壤酶活性可以帮助我们了解土壤中微生物的活动水平和土壤中有机物的分解能力，从而判断土壤的肥力和健康状况。

本文将介绍几种常用的测土壤酶活性的方法。

一、脲酶法测定土壤酶活性脲酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。

该方法是通过测定土壤中脲酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。

脲酶是一种催化尿素分解的酶，可以将尿素分解为氨和二氧化碳。

测定土壤中脲酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。

脲酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有尿素和缓冲液的试剂混合。

2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。

3. 用碱性试剂滴定未反应的尿素，计算出脲酶的活性。

二、过氧化氢酶法测定土壤酶活性过氧化氢酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。

该方法是通过测定土壤中过氧化氢酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。

过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可以将过氧化氢分解为水和氧气。

测定土壤中过氧化氢酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。

过氧化氢酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有过氧化氢和缓冲液的试剂混合。

2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。

3. 用碱性试剂滴定未反应的过氧化氢，计算出过氧化氢酶的活性。

三、醋酸红法测定土壤酶活性醋酸红法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。

该方法是通过测定土壤中醋酸红酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。

醋酸红酶是一种催化醋酸红分解的酶，可以将醋酸红分解为醋酸和二氧化碳。

测定土壤中醋酸红酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。

醋酸红法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有醋酸红和缓冲液的试剂混合。

2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。

3. 用碱性试剂滴定未反应的醋酸红，计算出醋酸红酶的活性。

测定土壤酶活性可以通过脲酶法、过氧化氢酶法和醋酸红法等方法来进行。

文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。

从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。

对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。

[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。

按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。

内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。

外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。

按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。

按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。

根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。

种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。

2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。

相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。

在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。

如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。