%94 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离

小鼠外周血单个核细胞分离、纯化①徐太哲1，李丽2，王长山2（1．佳木斯市红十字医院，黑龙江佳木斯154003；2．佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007）摘要：目的：探讨小鼠外周血单个核细胞（PBMC）最佳分离条件，提高细胞获得率与纯度，以便后续分子生物学实验。

方法：小鼠摘除眼球取血，设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化，分别采用EDTA－K2、肝素、枸橼酸钠抗凝，Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞，直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度，计数存活率。

结果：Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。

结论：Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。

关键词：小鼠；Ficoll密度梯度离心；PBMC中图分类号：Ｒ446．11+3文献标识码：A文章编号：1008－0104（2016）04－0010－02外周血单个核细胞（Peripheral blood mononucle-ar cells，PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞。

是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。

研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll－hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离［1］。

离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。

PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCＲ等后续试验结果。

实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。

1材料和方法1．1材料与分组BALB/c小鼠18只，5 6月龄，体重23 25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

室温水平离心2000转/分钟，30分钟。

３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。

４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。

方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。

加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。

实验名称：中药四君子汤对小鼠免疫调节作用的研究实验日期：2023年10月25日一、实验目的1. 观察中药四君子汤对小鼠免疫器官（脾脏、胸腺）的影响。

2. 分析中药四君子汤对小鼠免疫细胞（T细胞、B细胞）功能的影响。

3. 探讨中药四君子汤在免疫调节方面的作用机制。

二、实验原理中药四君子汤是由人参、白术、茯苓、炙甘草组成，具有健脾益气、调和脾胃的功效。

本实验通过观察中药四君子汤对小鼠免疫器官和免疫细胞的影响，探讨其在免疫调节方面的作用。

三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠40只，体重18-22g，雌雄各半。

2. 主要试剂：中药四君子汤提取物、ELISA试剂盒、流式细胞仪检测抗体、细胞培养试剂等。

3. 仪器：显微镜、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。

四、实验方法1. 实验分组：将40只小鼠随机分为5组，每组8只，分别为正常对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。

2. 模型制备：除正常对照组外，其余各组小鼠均采用环磷酰胺腹腔注射法建立免疫抑制模型。

3. 给药：正常对照组和模型组给予生理盐水，低剂量组给予0.1g/kg中药四君子汤提取物，中剂量组给予0.3g/kg中药四君子汤提取物，高剂量组给予0.5g/kg中药四君子汤提取物，连续给药7天。

4. 取材：实验结束后，各组小鼠脱颈椎处死，取脾脏、胸腺组织，并分离T细胞、B细胞。

5. 免疫器官指数测定：称量脾脏、胸腺重量，计算免疫器官指数（脾脏指数=脾脏重量/体重，胸腺指数=胸腺重量/体重）。

6. T细胞、B细胞功能检测：采用ELISA法检测T细胞、B细胞功能指标，包括T 细胞增殖实验、B细胞抗体生成实验等。

7. 数据统计：采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。

五、实验结果1. 免疫器官指数：与模型组相比，低、中、高剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均显著升高（P<0.05）。

2. T细胞功能：与模型组相比，低、中、高剂量组小鼠的T细胞增殖实验结果显示，增殖能力显著提高（P<0.05）。

“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。

1/ 1。

医学免疫学实验指导病原生物与免疫学教研室实验一免疫系统组织和细胞形态学一、实验目的观察小鼠胸腺、脾脏等免疫器官及免疫细胞二、实验内容机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。

该系统具有识别和排除抗原性异物、维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，是执行体液免疫和细胞免疫的物质基础。

本次实验主要观察免疫器官大体解剖学、免疫细胞的形态学特征。

小鼠是啮齿目中体形较小的动物，淋巴系统很发达，包括胸腺、脾脏、淋巴管、外周淋巴结及肠道派氏集合淋巴结。

本实验在带教老师指导下，解剖小鼠，观察胸腺、脾脏等免疫器官，并制血涂片，观察小鼠免疫细胞。

（一）小鼠免疫器官解剖学观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。

２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液。

３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。

【方法】１小鼠脱臼处死，投入盛有3%来苏尔水的缸内，浸泡5分钟。

取出小鼠，仰卧位置于试验台上，使动物腹部朝上。

２以镊子提起耻骨处皮肤，用剪刀沿正中线直剪开至下颌部，然后钝性分离皮肤，再把皮肤向四肢剪开。

３注意观察腹壁，用剪刀沿正中线自阴部至膈肌为止剪开，观察腹腔液量及性状，观察脾脏。

４切开膈肌，剪断胸骨，翻起胸骨，观察胸腺、心脏及肺脏，胸腺位于小鼠胸腔心脏前上方，内有许多大淋巴细胞（即前胸腺细胞）及特定的上皮网状细胞（分泌胸腺激素）。

５解剖结束，深埋动物。

（二）免疫细胞的形态观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。

２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液，pH8.6硫酸盐缓冲液，20%盐酸甲醇。

３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。

【方法】１准备洁净玻片两张，一张用于推片，另一张用于固定标本。

２剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制备血涂片，自然干燥。

３瑞氏染色（１）染色：甲醇固定标本２分钟（亦可省略），滴加瑞氏染液数滴覆盖血膜，染色１分钟，再加等量的pH8.6硫酸盐缓冲液或新制蒸馏水，用洗耳球吹打，使之与染液混匀，静置染色8～10分钟，弃去染料，水洗。

（２）脱色：用20%盐酸甲醇脱色，肉眼观察玻片呈粉红色为宜，显微镜下观察结果。

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

小鼠脾脏内皮祖细胞的分离和培养赵晓辉;黄岚;尹扬光;周健;方玉强;朱光旭;陈剑飞;刘兰;崔斌【期刊名称】《心脏杂志》【年(卷),期】2006(18)5【摘要】目的探讨小鼠脾脏内皮祖细胞(endothelial progen itor cell,EPC)的体外分离,定向分化和培养方法。

方法梯度密度离心法从小鼠脾脏中分离单个核细胞,用含血管内皮生长因子的M199培养液培养,每4 d更换培养基去除非贴壁细胞,观察经过不同时间培养后的细胞形态、结构和功能变化。

结果培养4 d可发现梭形贴壁细胞,7d后细胞成集落状,14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21 d左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列。

培养7 d透射电镜可见特征性的W e ib le-Palade小体存在,细胞CD31表达阳性,细胞D iI-LDL摄取试验阳性,FITC-UEA-I染色阳性;流式细胞仪检测细胞Sca-1及VEGFR-2的总阳性率分别为(34.6±3.8)%和(50.5±4.9)%,且该细胞具有体外成血管能力。

结论通过密度梯度离心联合贴壁筛选可以获得脾脏EPC。

【总页数】4页(P532-535)【关键词】内皮祖细胞;细胞培养;脾脏;小鼠【作者】赵晓辉;黄岚;尹扬光;周健;方玉强;朱光旭;陈剑飞;刘兰;崔斌【作者单位】第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.大鼠脾脏内皮祖细胞的分离培养及鉴定 [J], 邓梦杨;陶剑群;朱晋坤;王航;赵晓辉;崔斌;尹扬光;黄岚2.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 罗伟;李翔翮;杨先腾;李森磊;王远政;张一;田晓滨;孙立3.小鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 [J], 胡若愚;承燕;李好;张雷;景华;吴海卫4.小鼠髓源性内皮祖细胞体外培养的两种不同分离方法的比较 [J], 吴瑞影;许建华5.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 李美玲;刘凤姣;刘玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

单核细胞分离方法嘿，你知道吗？单核细胞那可是身体里的小卫士呢！那怎么把它们分离出来呢？这就好比在一堆宝藏里找出最闪亮的那颗宝石。

首先说说分离单核细胞的步骤吧。

第一步，采集血液样本，这就像是开启一场神秘的探险，从身体这个大宝库中取出关键的线索。

把血液收集到合适的容器中，一定要小心操作，可不能让这珍贵的样本受到污染哦！第二步，进行密度梯度离心。

这就如同在一个大旋转木马上，不同密度的东西会被分到不同的位置。

通过特定的离心力，让血液中的各种成分根据密度分层。

单核细胞就在其中一层等待着被发现呢。

第三步，收集含有单核细胞的那一层。

哇，这感觉就像在一堆沙子里找到了那颗闪闪发光的金子，超有成就感的！在这个过程中有啥注意事项呢？那可不少呢！采集血液的时候，一定要确保无菌操作，不然就像在干净的花园里突然闯进了一群捣乱的小怪兽，会把整个实验搞砸。

离心的时候，速度和时间都得把握好，稍有差错，就可能让单核细胞迷失方向。

还有，使用的试剂也得是高质量的，不然就像给战士配上了劣质的武器，怎么能打胜仗呢？那这个过程安全吗？稳定性咋样呢？放心吧！只要严格按照步骤操作，就像走在一条稳稳当当的大路上，安全得很呢。

而且这个方法经过了无数次的验证，就像一个久经沙场的老将，可靠性极高。

只要不出现意外情况，比如突然停电或者操作失误，分离过程是非常稳定的。

单核细胞分离出来有啥用呢？应用场景那可多了去了。

在医学研究中，研究人员可以通过分析单核细胞来了解疾病的发生机制，这就好比是侦探在寻找案件的线索，为攻克疾病提供重要的依据。

在临床治疗中，有时候需要提取患者的单核细胞进行特殊处理后再回输到体内，增强患者的免疫力，哇，这简直就是给身体派来了一支超级救援队。

它的优势也是杠杠的！分离出来的单核细胞纯度高，就像一颗纯净的钻石，没有杂质的干扰。

而且操作相对简单，不需要特别复杂的设备，就像用一把普通的钥匙就能打开一扇神秘的大门。

来个实际案例吧！有个研究团队在研究某种罕见病的时候，就通过分离单核细胞，发现了疾病的关键线索。

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。

腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。

3～4天以后收集腹腔细胞。

2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。

放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。

消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。

轻轻按摩腹部5分钟。

3．以下均无菌操作。

剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。

合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。

仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。

以下过程注意无菌操作。

小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。

用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。

向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。

用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。

再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。

平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。

如何从⼩⿏脾脏制备单细胞悬液？从原代组织样本中制备真正的单细胞悬浮液可避免过量的细胞损失并且能够最⼤化标记靶细胞，从⽽优化细胞分选。

以下实验步骤概述了如何从脾脏样本中收集细胞，并制备成单细胞悬液以进⾏下游细胞分选。

实验步骤1. 将脾脏组织转移到35 mm⽆菌培养⽫（产品号 #27100/27150）中。

后续如需进⾏细胞分选，在培养⽫中加⼊5 mL推荐培养基（请参阅试剂盒产品说明书）。

如解离组织后不需细胞分选，请在培养⽫中加⼊含1 mM EDTA的PBS。

注意: 如同时处理多个脾脏样本，需使⽤100 mm培养⽫（产品号 #27125/27127），并加⼊10 mL培养基。

2. 去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，注意坏死区域，并检查脾脏是否有肿⼤、变⾊或病变。

记录起始样本的状态对于后期评估细胞⾮常重要。

3. 从3 cc⽆菌注射器（产品号 #28230/28240）中取出活塞/柱塞。

使⽤扁平的末端部分以温和画圆的⽅式研磨脾脏5次。

这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞。

4. 将⼀个70 µm细胞过滤器（产品号 #27216/27260）置于50 mL⽆菌锥形管上，并⽤2 mL推荐培养基润洗滤⽹。

注意：细胞可能会黏附于⼲燥的滤⽹上，润洗滤⽹可以减少这种情况。

5. 使⽤润洗过的5 mL或10 mL移液管将脾细胞吹打均匀。

6. 将上清液和组织从培养⽫转移⾄润洗过的70µm细胞过滤器（产品号 #27216/27260）。

使⽤⼀个新的3 cc⽆菌注射器的活塞/柱塞，以温和画圆的⽅式使细胞和组织通过滤⽹。

⽤3 mL推荐培养基冲洗滤⽹。

如需提⾼回收率，可选择进⾏此步骤：a. 只将上清液⽽不要将脾脏组织移⼊过滤器。

在培养⽫中另加⼊5 mL推荐培养基。

注意：如果⼀次处理多个脾脏可加⼊10 mL推荐培养基。

b. 重复步骤4-6，在培养⽫中加⼊推荐培养基（5 mL或10 mL）直⾄脾脏组织变⽩且培养基呈现澄清状态。

小鼠淋巴细胞分离液说明书Cat#:DKW33-R0100本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。

主要成份为Iodixanol ，分子量为1550。

它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。

EZ-Sep™Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。

本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达1小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和质量没有明显变化，随后的ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。

产品信息：商品名：EZ-Sep™Mouse 1×（英文）易得小鼠淋巴细胞分离液（中文）规格：100mL/瓶密度：1.0810±0.0005g/mL (20ºC)渗透压：280±15mOsm主要成份：Iodixanol ，化学惰性，无生物毒性内毒素：≤0.5EU/mL适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞分离大鼠/兔子血液中的PBMC保存方法：4ºC 避光保存，保持无菌保质期：12个月使用方法：自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200目尼龙网——裁成90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求）、其他常用器材：离心管，移液管，加样枪，离心机等实验步骤：1.断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中。

2.在超净台中取出小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3.在35mm 培养皿中放入4-5mL EZ-Sep™Mouse 1×淋巴细胞分离液（取用前摇匀）。

研磨（研磨操作请参考图二）。

4.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL 离心管中，覆盖200-500uL 的1640培养基（保持液面分界明显）。

5.室温，800g 离心30min 。

小鼠免疫器官的认识实验报告好嘞，咱就来说说小鼠免疫器官的认识实验报告这事儿。

你要是想了解小鼠的免疫器官，就像是要去探索一个小王国里的防御系统。

这小鼠啊，别看它小，它的免疫器官可是很有门道的。

先说说那胸腺吧。

胸腺就像是一个新兵训练营，专门训练那些年轻的免疫细胞，也就是T细胞啦。

你想啊，那些刚冒出来的小细胞，就像一群刚入伍的小娃娃，啥都不懂呢。

到了胸腺这个训练营，就得接受各种严格的训练，学习怎么识别敌人，怎么保护自己的身体王国。

这胸腺的结构也很有趣，就像一个精心设计的学校，有不同的区域，不同的功能。

在实验的时候，你要是观察胸腺，可得小心仔细喽。

它的大小啊，颜色啊，质地啊，都是能告诉我们很多信息的。

比如说，如果胸腺变小了或者颜色不对劲，那就像是训练营出了问题，可能是小鼠身体里有啥情况影响到了这个训练新兵的地方。

再讲讲脾脏吧。

脾脏就像是身体王国的一个多功能战斗堡垒。

这里面可热闹了，既有储存血液的功能，又像是一个战场，免疫细胞在这里跟外来的敌人打仗呢。

把脾脏想象成一个大集市，各种细胞在这儿来来往往，交换信息，一有外敌入侵，就马上集合起来战斗。

在实验中，研究脾脏可不容易。

你得看看里面细胞的分布，就像在集市里找不同的摊位一样。

脾脏里面的白髓就像是指挥中心，红髓呢，更像是后勤保障的地方。

要是在脾脏里发现了一些奇怪的细胞聚集或者病变，那就像集市里出了乱子，肯定是有啥东西打破了原来的平衡。

还有那淋巴结，淋巴结就像是一个个小哨所。

它们分散在小鼠的身体各处，像是一个个警惕的小卫士站。

外来的病菌啊什么的，就像小偷一样，想偷偷潜入身体王国。

淋巴结这个小哨所可不会轻易放过它们。

一旦发现可疑的东西，淋巴结里的免疫细胞就会像警报器一样拉响警报，然后开始战斗。

在实验观察淋巴结的时候，你就像是在检查一个个小哨所的工作状态。

如果淋巴结肿大了，就像是小哨所发现了大量的敌人，正在严阵以待呢。

做小鼠免疫器官的认识实验，就像是在揭开一个神秘的小世界的面纱。

提取小鼠体内脾细胞实训过程记录实验目的：通过体内脾细胞提取，研究免疫细胞的增殖、分化和功能等方面的生理生化特性。

实验原理：小鼠脾脏是免疫细胞的主要器官，其中包含了大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

提取小鼠脾细胞，可用于免疫细胞的培养、表型分析、功能研究等。

实验步骤：1.小鼠剖腹取脾：先在实验动物按照规范的动物操作技术下施行人道安乐死，随后对小鼠进行无菌外科手术，在消毒的手术台上固定小鼠，并用无菌剪刀切开腹部，显露腹腔。

定位到脾脏后，用消毒的剪刀和镊子轻轻牵引脾脏，将脾脏完整地取出。

2.清洗脾脏：将取出的脾脏置于无菌PBS缓冲液中，用无菌镊子和剪刀把脾脏上的脂肪和血管组织清除干净，并将脾脏放入含无菌PBS的培养皿中。

3.细胞提取：用无菌注射器灌注0.5mL无菌PBS缓冲液，将其注入脾脏中，用剪刀剪碎脾脏组织，使细胞充分分散。

接着，将脾脏组织转移到一个50mL离心管中，并加入5mL无菌PBS缓冲液。

用离心机将脾脏组织沉淀离心，将上清液倒掉，沉淀的细胞被称为脾单细胞悬液。

4.细胞计数：将脾单细胞悬液重新悬浮在含PBS的15mL离心管中，用显微镜和细胞计数板计数细胞。

根据计数结果，计算细胞的浓度。

5. 离心沉淀：将细胞悬液倒入离心管中，并进行离心，离心速度约为1500 rpm，离心时间为5分钟。

离心后，将上清液丢掉，离心管中的细胞沉淀称为脾细胞。

6.细胞培养：将脾细胞再次悬浮在含有适当培养基的培养皿中，加入足够的细胞密度，放入恒温培养箱中培养。

培养条件根据不同实验的要求进行设置，一般情况下，培养基中含有的细胞因子、血清和其他添加剂都是必要的。

7.实验后处理：根据具体实验要求，对培养的脾细胞进行进一步的实验处理，如分离、染色、鉴定、培养基替换等。

实验注意事项：1.手术操作时要注意无菌操作，避免污染。

2.取脾脏后要迅速进行后续操作，避免细胞损伤。

3.细胞培养过程中，要保持适当的温度和湿度，以及细胞所需的培养基成分。

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。