Countstar Rigel全自动荧光细胞分析仪在细胞冻存复苏过程中的应用

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Countstar Rigel全自动荧光细胞分析仪在细胞冻存复苏过程中的应

01
细胞存储方法
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一,主要用于细胞保种,同时也可用于购买、寄赠、交换和运输。

近年来,干细胞的研究越来越被人们关注,当下最热门的就是将自身或异体的健康的干细胞储存起来,可以在自身或亲属患病时启用细胞治疗的方法,使一些病症能得到有效治疗,为生命储存一份保险。

目前长期存储的方式大多采用-196度的液氮保存。

02
细胞冻存复苏过程中,影响细胞活力的因素
直接冻存细胞时,细胞内和外环境中水都会形成冰晶,能导致细胞内发生冰晶损伤、电解质升高、脱水、蛋白变性等,能引起细胞死亡。

所以在细胞冻存液中必须要加入冷冻保护液,通过降低冰点,然后在缓慢冻结的条件下使水份在冻结前透出细胞,最后存储在-130℃以下来减少冰晶的形成,从而保护细胞中一些重要的蛋白质和细胞器的功能。

常用的保护剂主要是二甲亚砜(DMSO)和甘油。

细胞复苏的时候要快速,让细胞迅速通过细胞最易受损的-50-0℃,从而保证细胞仍然可以生长、活力受损不大。

细胞冻存过程的制约因素:
1、需要存储的细胞状态,处于指数生长期、密度合适、状态好的样本冻存复苏效果好一些;所以冻存前的细胞需要确定其活率和浓度;
2、程序性降温步骤的控制,即冷冻速度的控制,过慢会导致细胞外溶质损伤,过快则会导致细胞内产生冰晶;
3、冻存过程细胞无污染;
4、冷冻保护剂的选择。

细胞复苏过程的制约因素:
1、37℃水浴,在1-2分钟内快速解冻,使细胞内不会形成较大的冰晶,也不会暴露在高电解质的溶液中过长,从而继续保持正常的结构和功能;
2、冷冻保护剂的去除,例如常温下,DMSO对细胞毒性作用比较大。

03
冻存复苏的细胞计数特点
冻存复苏的过程中,细胞损伤是不可避免的,细胞浓度活率计数在冻存和复苏的各个环节至关重要。

例如,如果冻存前的细胞浓度或活率过低,会导致细胞复苏后生长缓慢或者无法生长。

目前细胞计数方法主要是台盼蓝染色法计数、库尔特法及荧光染料法计数。

其中台盼蓝染色方法,因为其对蛋白质有很强的亲和力,需要用到不含血清的稀释液效果才会更好;另外,刚复苏的样本,台盼蓝染色结果不稳定。

库尔特法主要是根据细胞大小来区分细胞活率,更适合于纯的细胞系的检测。

2018年9月,美国药典(USP-NF)出台了关于细胞冷冻保存的政策,文中明确提出,对于
冻存复苏的样本,类似于台盼蓝的染料来检测细胞完整性的方法用的越来越少,因为其不能很好的辨别冻存和复苏的细胞,这种检测方法需要特定细胞种类并且指定合适的浓度和时间。

当下荧光染料越开越多的应用于复苏细胞的浓度活率检测。

详情请参考《USP General Chapter <1044> Cryopreservation of Cells》。

04
利用荧光染料法来精确测量冻存复苏的细胞样本
1、AO/PI染色法检测原理
吖啶橙(Acridine orange,AO)和碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)都可以对死、活细胞核中的DNA进行染色。

染色原理如图1所示。

该方法可以有效区分死细胞和碎片,以及减少细胞折光率改变对染色效果的影响。

图1:AO/PI染色法检测原理
2、培养过程中及冻存复苏后MSC细胞计数
培养过程中,MSC细胞台盼蓝染色方法与AO/PI染色方法结果对比如图2和表1所示。

图2. 培养过程中MSC细胞AO/PI及台盼蓝计数结果原始图片
表1. 培养过程中MSC细胞AO/PI及台盼蓝计数浓度及活率对比
结论:培养过程中MSC细胞AO/PI及台盼蓝计数浓度及活率无明显差异
冻存复苏的ASCs细胞台盼蓝染色方法与AO/PI染色方法结果对比如图3和表2所示
图2. 冻存复苏的ASCs细胞AO/PI及台盼蓝计数结果原始图片
表2. 冻存复苏的ASCs细胞AO/PI及台盼蓝计数浓度及活率对比
结论:冻存复苏的ASCs细胞AO/PI计数结果细胞活率明显低于台盼蓝计数
运输过程中的ASCs细胞台盼蓝染色方法与AO/PI染色方法结果对比如图4和表3所示
运输前
运输后
图4. 运输前后的ASCs细胞AO/PI及台盼蓝计数结果原始图片
表3 运输前后的ASCs细胞AO/PI及台盼蓝计数活率对比结果
结论:运输前细胞状态好,台盼蓝与AO/PI计数结果无明显差异;运输后的细胞样本,台盼蓝计数结果与运输前无明显差异,但是AOPI计数结果明显低于台盼蓝计数。

综上,从上述实验结果中观察到,不管是培养过程中还是运输前的状态比较好的细胞样本,台盼蓝计数与AO/PI荧光计数结果细胞活率保持一致;但对于冻存复苏及运输后复苏的样本,AO/PI活率明显比台盼蓝计数结果低。

类似的实验结果在很多地方得到验证,活率计算结果差异大小依据冻存效果不同有所波动。

所以选择countstar Rigel AO/PI荧光方法计数能更精确的区分冻存复苏细胞死活,从而反映更加真实的细胞活力状态。

05
总结
Countstar® Rigel荧光细胞分析仪
1、快速、精确计数和活率检测;
2、数据重复性好;
3、CCD的相机,可以得到清晰的细胞图片,有效排除背景杂信号干扰;
4、同时拍摄明场和荧光场的图片,相结合起来验证荧光结果;
5、软件系统的数据管理和控制性能完全符合GMP和FDA 21 CFR Part11法规。