口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)抗体检测试验

2019年第7期 吉林畜牧兽医·经验交流·JingYan JiaoLiu口蹄疫病毒抗体检测白 翠，王 楠，王 晶，马晓媛，于钦磊吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062摘 要：口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病，是由口蹄疫病毒引起的，常常发生在偶蹄动物，偶尔也见于人和其它动物。

世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病，我国将其列为一类动物疫病。

我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病，疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段，也可以根据免疫后的 效果来制定合理免疫程序。

本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。

关键词：口蹄疫；ELISA；抗体检测我国口蹄疫病毒流行毒株主要为A型、亚洲I型和O型，其中O型口蹄疫病毒基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展[1]。

1 液相阻断ELISA方法进行抗体检测液相阻断是应用双抗体夹心法，其试验过程是抗原吸附在载体上，也就是我们常说的包被，包被后加入待测抗体，反应后加相应酶标记抗体，生成抗原抗体复合物，再与底物发生显色反应。

最后通过酶标仪的光谱吸收，测量OD值，计算抗体的量。

本实验室的试剂盒主要是使用兰州兽医研究所（兰兽研）研制开发的，该试剂盒与其它同类型试剂盒相比，许多项指标都已达到了世界口蹄疫参考实验室的同类产品水平，符合率极高。

液相阻断的难点重点在于被检血清的稀释倍数，这个在试剂盒说明书上有具体操作步骤，实验室操作人员可根据说明书进行10份或20份样品的操作。

2 3ABC非结构蛋白抗体检测经抗原纯化过的口蹄疫疫苗，去除了绝大部分3ABC非结构蛋白[2]，因此，用灭活疫苗免疫的健康动物体内正常不会有3ABC非结构蛋白抗体产生，而自然感染的动物体内由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大，不仅产生了结构蛋白而且也产生3ABC非结构蛋白抗体。

所以，用该方法可以区分自然感染和免疫抗体。

应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物148中国人兽共患病ChineseJournalofZoonoses文章编号:1002—2694(2O11)11—0148—04应用I:1蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物张润祥,高明春,王君伟中图分类号:S855.3文献标识码:B口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的以感染牛,猪,羊等偶蹄动物为主的急性,热性,高度传染性疫病.世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一.发达国家往往通过捕杀感染动物和接触易感动物,限制动物及其产品移动来控制和消灭本病,但2001年英国暴发口蹄疫后,欧盟允许在暴发口蹄疫时进行紧急疫苗接种,即实行"免疫存活"政策口].大多数发展中国家主要采取疫苗免疫的综合防控策略来控制该病.在采取捕杀政策的国家,如何检测隐性感染动物,在疫苗免疫国家如何区分自然感染和免疫动物一直是控制和消灭FMD的重要问题.因而,建立准确,实用,快速的鉴别自然感染和疫苗免疫动物的方法必然成为防控FMD的关键技术.现对FMDV非结构蛋白(NSP)在鉴别诊断领域的应用及进展作一简要介绍.1口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断的理论依据目前使用的FMD疫苗主要为灭活疫苗,去除了除3D外的绝大部分NSP.疫苗免疫动物后,机体不产生针对NSP的抗体;动物感染FMDV后,在病毒到达的嗜性组织中均有病毒增殖,刺激机体产生的抗体既有针对结构蛋白(SP)的,也有针对NSP的;而病毒携带者,即FMD持续性感染动物也会产生抗NSP抗体.因此通过检测NSP抗体可以从免疫动物中区分出自然感染动物或持续性感染动物.2口蹄疫病毒NSP免疫特性和抗体消长FMDV的NSP有I,2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D及它们的前体,清楚了解各NSP在感染动物体内的免疫原性和抗体消长,为选择合适的NSP建立高敏感性和特异性的诊断方法提供理论基础.FMDV的I蛋白免疫原性很弱,感染动物即使产生抗体,持续时间也比较短,所以检测L蛋白抗体不能确定动物感染与否].2A只有16-20个氨基酸,至今未在其上发现抗原表位.2B含有B细胞*现代农业产业技术体系建设专项资金(No.nycytx一0303);国家科技支撑计划(No.2006BAD06A17-08)联合资助通讯作者:王君伟;Email:jwwang@作者单位:东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030表位,但抗2B抗体在ElISA反应中重复性不好,不宜作为检测抗体].动物感染FMDV300d后仍能检测出2C抗体],但免疫动物体内短暂含有2C抗体|5].Mezencio等检测了不同来源感染动物和免疫动物血清的2C抗体,发现猪,牛血清中的2C抗体消退得比3ABC快,且免疫动物中存在1～2的阳性畜_6.多项研究表明检测3ABC抗体是最可靠的衡量感染与免疫动物的指标"].Bergmann_】和So—rensen..分别用原核表达系统和真核表达系统表达了各NSP蛋白,证明3ABC及其裂解组分是最合适的鉴别诊断抗原,其中3A免疫原性最强,3C免疫原性较弱,感染奶牛血清7～10d即可检测到3ABC,3A和3B的抗体,21d左右达到高峰,随后逐渐下降,395d时抗体仍为阳性.随后Bergmann用NSP—ELISA检测感染FMDV的畜群,在900d内, 群体中同时存在着阳性和阴性畜,揭示3ABC抗体在持续性感染牛体内可能超过3年.Malirat证实3ABC抗体在人工感染动物持续742d¨6.对3B抗体的研究表明,牛和猪在364d和301d检测仍为阳性.3D是NSP中抗原性最强的蛋白之一,没有型特异性,用3D免疫扩散试验检测感染牛,4～7d可检出抗体,持续时间长达3～5个月或更长时间.检测其抗体是评价动物是否接触过口蹄疫的重要指标,过去一度是国际贸易必检项目.目前认为仅测定3D抗体不能区分感染动物与免疫动物,因为在免疫动物体内也能检测到3D抗体.3口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断的研究现状1970年McVicar等首次报道了以3D为抗原的琼脂扩散(AG1D)试验,可用于鉴别诊断免疫和感染动物,但在应用过程中发现免疫动物体内存在3D 抗体.因此自上世纪9O年代起,许多实验室开始用其它NSP取代3D.1990年Berger等用放射免疫沉淀试验发现免疫动物血清中除有3D抗体外,偶有短暂的2C抗体,他建议使用2B,3AB1和3C为检测抗原区分疫苗免疫和自然感染动物.1993年,Bergmann等用建立的免疫印迹试验分析大肠2期张润祥等:应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物149 杆菌表达的NSP抗原性,发现标准疫苗免疫的牛血清不与任何非结构蛋白反应.Rodriguez等用重组非结构蛋白3ABC为抗原,用免疫印迹法和ELISA区分灭活苗免疫猪和自然感染猪,结果发现3ABC能够鉴别康复猪和免疫猪,但2C和3D抗原则无此功效.Bergmann和Rodriguez的结果不一致,Iubroth分析可能是由天然抗原和生物工程抗原构型差异导致检测结果的偏差.且发现2C抗体在动物体内持续时间比3ABC短;给动物注射3次疫苗,均检测不到2C,3ABC的抗体,但在第1次注射疫苗后的第19d就检测到3D抗体,因此2C和3D不是鉴别诊断的适合抗原L4J.迄今为止,国内外发展了多种基于3ABC及其裂解组分的检测方法l_2"¨.其中原核表达蛋白是最常用的检测抗原.1997年Diego以大肠杆菌表达的FMDV3ABC和抗3A单抗,建立了单抗捕获ELISA,成为意大利的内部(in—house)质控方法[1.1998年泛美口蹄疫中心(PAHO/wHO)的Malirat等详细比较了3ABC—I—EIIsA和酶联免疫电转印技术(EITB)鉴别感染动物的效果,认为前者是大规模动物检疫,区分疫苗免疫和自然感染动物的最有效方法l_6].2000年Bergmann进一步发展了这2种技术,在大规模流行病学监测时用3ABc—I—ELISA初筛,EITB确诊,配合使用最大限度地保证检测准确性].随后用此ELISA检测不同地区的100000份牛血清,为NSP血清流行病学调查做了深入研究,证明了3ABC方法的实用性ll..发展成为OIE指定的参考方法(NcPanaftosa—screen—ingtest).国内朱彩珠用大肠杆菌表达的3ABC建立了一种可区分自然感染与疫苗免疫牛的间接EIISAE].随后曹轶梅,卢曾军等]以原核表达的3ABC为检测抗原建立了鉴别诊断牛,猪,羊的间接ELISA试剂盒,临床大规模应用表明具有较好的敏感性和特异性,与Ceditest~试剂盒的符合率为98.05(302/308),与UBI试剂盒的符合率为93.2(287/308),成为国内防控口蹄疫进行NSP血清监测的参考方法.真核表达系统与原核表达系统相比有许多优点,例如表达蛋白的糖基化,表达产物中无引起非特异性反应的细菌蛋白污染等.Sorensen用杆状病毒表达系统高效表达了3D,3AB和3ABC,并使用3 种抗原分别建立竞争EIISA.3种方法在人工感染的牛和羊8d到10d后均可检测到特异性抗体,其中牛的抗体可持续395d以上,进一步证明了3AB和3ABC—ELISA作为鉴别诊断方法的可靠性_1. Chung等用此3AB—EIISA用于台湾猪FMD的清除计划,结果发现育肥猪和母猪感染后抗体阳性期持续16星期到3.5年,猪10次免疫后仍未检测到抗体口.2005年Sorensen对前期建立的竞争EIISA做了改进,用抗3B单抗L74D5,代替豚鼠抗血清作为包被抗原捕获3ABC,同时用辣根过氧化物酶标记此单抗作为竞争抗体,进一步提高了检测特异性.发展成为国际知名的Ceditest~FM—DV—NS检测试剂盒,具有广泛的应用.然而一些在牛体上的实验也显示,少数免疫动物体内存在3A抗体,这有可能是疫苗中微量的3A蛋白残留,也有可能是一些交叉抗原的抗体所致.总之,这会影响基于3ABC或3AB检测方法的特异性.近年在FMDV鉴别诊断抗原的研究中越来越倾向于使用3ABC中更小的抗原性短肽或抗原表位.抗原表位多集中于3B上,71个氨基酸含有至少7个不同的抗原表位,且这些表位与相应抗体的结合力极高口],因此应用这些表位进行鉴别诊断有很高的特异性.Shen等于1999年合成涵盖了2C和3ABC的氨基酸序列的重叠多肽片段,鉴定出FMDV A12株上的数个B细胞抗原表位,随后合成了3B上57个氨基酸短肽,并在检测多种动物血清中证明了合成肽ELISA用于鉴别诊断的有效性_】.基于此,美国联合生物制药公司(UBI)在2000年推出合成肽EIISA试剂盒,已在多个国家和地区使用.SunTao等人采用基因分段表达法,筛选到()/HKN/14/82株FMDV3ABC上高结合力,保守的2个感染相关线性表位,用表达的串联了6段表位的多肽建立了间接ELISA用于猪的鉴别诊断.韩国学者在2007年建立的表位阻断EIISA(epitope—blockingELISA),敏感性和特异性分别是98和100,所用单抗针对的表位与H01ich等所鉴定出的3B核心重复基序QKPIK 相.4口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断面临的问题和解决方案4.1灭活疫苗中含有痕量NSP蛋白即便现代疫苗生产的工艺已经很高,但FMD疫苗仍含有痕迹量的NSP,完全去除NSP所投入的成本对某些发展中国家是难以承担的.免疫特别是多次重复免疫之后,痕量的NSP蛋白可能刺激机体产生抗体,但除3D外,其他NSP抗体水平很低.Lee等用2种商品化试剂盒检测台湾人工重复免疫牛和田间免疫牛时,发现多次免疫牛特别是大于2岁的牛能检测出NSP抗体.Bergmann在EITB中,偶尔也发150中国人兽共患病现重复免疫的老龄牛血清可与5个非结构蛋白(2C,3A,3B,3ABC和3D)中的一个或多个发生反应.他建议为了避免假阳性,应采2岁以下牛的血清检测.也可用NSP短肽或表位ELISA增加检测的特异性.所以在进行血清学调查时,应充分考虑动物年龄,免疫史,健康状况和所用疫苗的纯度等. 4.2重组抗原与被检动物自身的无关抗体存在交叉反应目前用于鉴别诊断的抗原大多是重组表达蛋白.所面临的问题一是难以排除表达系统蛋白的干扰,二是重组抗原含多个表位可能和其他小核糖核酸病毒形成交叉反应.Shen等人在既没感染也未免疫的动物血清中发现大肠杆菌抗体,同样对昆虫蛋白抗原观察的结果表明它们能导致非特异性反应.Shen等用化学合成肽ELISA部分解决了这一问题口.也可在血清稀释液中加入大肠杆菌裂解液等阻断试剂来提高检测方法的特异性l_7'9,11].4.3单一NSP方法对持续性感染动物检出能力不足多项研究表明单一的NSP—EIISA很难区分携带者(carriers)和仅仅是接触过口蹄疫病毒但感染后又快速完全清除病毒的康复动物,特别是检测持续性感染的动物,NSP方法的敏感性较低. Bergmann用OIE参考方法3ABC—I—ElISA检测临床持续性感染牛和亚临床感染牛的敏感性低于97,他分析这种现象与奶牛处于高免疫抗体水平的压力,暴露于病毒的时间太短等因素有关l_】.因此单一的NSP—EIISA在免疫牛群中检测不到NSP 抗体,并不能完全代表此牛群无携带者2.针对这种情况,各国学者提出了如下解决办法:1)配合使用3ABC—ElISA和EITB,前者用于筛查,后者用于确诊.2)采用2种或2种以上ELISA方法以获得临床检测上的高度敏感性和特异性[2.3)采取咽/食道分泌物(()/P液)进行病毒分离和PCR检测及检测唾液IgA抗体综合确诊持续性感染动物.4)采用新型诊断技术如液相微阵列技术检测多种NSP抗体.44NSP诊断方法的标准化各种NSP诊断方法都是在不同国家和地区单独建立起来的,需要评价其在不同地区检测不同状态(天然,免疫,未免疫感染,免疫感染,持续性感染等)动物的特异性和敏感性.2004年起,英,意,荷等多国科学家对来源于多个国家的牛,羊,猪等3551份血清进行了比较检测,评估6种ELISA方法的实效性l2.然后通过贝叶斯分析,ROC曲线和极大似然值法比较分析各ELISA的检测能力.英国Pirbright实验室和泛美VI蹄疫中心分别制作了牛血清盘,作为参考或质控血清评估各种NSP方法_l2.NSP方法的规范化和标准化,利于全球协作防控FMD.5口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断的新思路为适应快速,准确鉴别FMD感染动物和免疫动物的需求,NSP诊断技术向着简便,实用,高特异性和敏感性方向发展.目前有如下探索:1)提高基于重组蛋白和单抗的NSP抗体检测方法的特异性和敏感性,如发展针对3ABC及其表位的竞争和阻断EIISAllJ.2)建立一步法ElISA.Foord等用噬菌体展示肽库技术,获得鸡重组抗口蹄疫病毒抗体(CRAb—FM),将针对3B的单链抗体和碱性磷酸酶重组表达后和被检血清共同孵育,加底物显色,发展了一步法竞争ELISAEso].体现了试剂的均一性和短时间内制备出大量试剂的优越性.3)发展多重抗原检测技术(MultiplexedNSPassay).应用NSP和表位肽建立的多重EIISA可以提高鉴别诊断方法的特异性和敏感性llJ.2007年,Perkins等运用Iuminex液相芯片技术对感染和免疫动物的FMDVNSP3ABC,3A,3B和3D进行检测研究.他们将合成和重组表达的NSP共价结合在带一定比例红橙荧光染料微球的羧基端,再用Iumi—nex系统检测.1h内完成试验,初步估算每个样品耗费0.5美元,适合于大规模血清学监测.4)适用于现场应用的免疫胶体金层析试纸在多个国家的实验室正在研制中.参考文献:[1]UttenthalA,ParidaS,RasmussenI'B,eta1.Strategiesfordif—ferentiatinginfectioninvaccinatedanimals(DIV A)forfootand mouthdisease,classicalswinefeverandavianinfluenza[J].Ex pertRevVaccines,2010,9(1):7387.[2]MackayDK,ForsythMA,DaviesPR,eta1.Differentiating infectionfromvaccinationinfoot——and—-mouthdiseaseusingapanel ofrecombinant,nonstructuralproteinsinEIISA[J].V accine,1998,16(5):446—459.[3]HohlichBJ,WiesmullerKH,Schlapp—I,eta1.Identificationof foot——and——mouthdiseasevirus——specificlinearBcellepitopestOdif——ferentiatebetweeninfectedandvaccinatedcattle[J].JVirol.2003,77(16):86338639.[4]LubrothJ,BrownF.Identificationofnativefoot—and—mouthdis—easevirusnon—structuralprotein2【:asaserologicalindicatorto differentiateinfectedfromvaccinatedlivestock[J].ResVetSci,1995,59(1):7078.[5]BergerHG,StraubOC,AhlR,eta1.Identificationoffoot—and——mouthdiseasevirusreplicationinvaccinatedcattlebyanti-- bodiestonon—structuralvirusproteins[J].Vaccine,1990,8(3):213216.r6]MaliratV.NeitzertE,BergmannI.E,eta1.Detectionofcattle2期张润祥等:应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物151 exposedtofoot——and—-mouthdiseasevirusbymeansofanindirect ElISAtestusingbioengineerednonstructuralpolyprotein3ABC.[J].VetQ,1998,2OSuppl2:$24$26.[7]Iuz,CaoY,GuoJ,eta1.Developmentandvalidationofa3ABCindirectEIISAfordifferentiationoffoot—and—mouthdis—easevirusinfectedfromvaccinatedanimals[J].VetMicrobiol,2007,125(1—2):157-169.[8]MoonenP,JacobsI,CrienenA,eta1.Detectionofcarriersof foot—and—mouthdiseasevirusamongvaccinatedcattle[J].VetMicrobiol,2004,103(34):151160.[9~BergmannIE,MaliratV,NeitzertE,eta1.Improvementofa serodiagnosticstrategyforfoot—and—,mouthdiseasevirussurveil—_ lanceincattleundersystematicvaccination:acombinedsystemofanindirectE1ISA一3ABCwithanenzyme—linkedimmunoelectrotransferblotassay[J].ArchVirol,2000,145(3):473—489. 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牛口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)定量检测试剂盒（ELISA）使用说明书【试剂盒名称】牛口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)定量检测试剂盒（ELISA）【试剂盒用途】定量检测牛血清、血浆及相关液体样本中口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)的含量。

【检测原理】本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。

将标准品、待测样本加入到预先包被牛口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)多克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。

依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中牛口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中牛口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)含量。

【试剂盒组成】1 酶标包被板12孔×8条7 底物夜A 6mL2 标准品：80ng/ml 0.6mL 8 底物夜B 6mL3 20倍浓缩洗涤液20mL 9 终止液6mL4 标准品稀释液6mL 10 说明书1份5 样本稀释液6mL 11 封板膜1张6 酶标试剂6mL 12 密封袋1个备注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：80、40、20、10、5、2.5ng/ml【需要而未提供的试剂和器材】1、37℃恒温箱2、标准规格酶标仪3、精密移液器及一次性吸头4、蒸馏水5、一次性试管6、吸水纸【操作步骤】1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。

4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断酶联免疫吸附试验诊断
ELISA试剂盒
用途特点：
本产品主要用于重大动物疫病口蹄疫病毒（FMDV）感染抗体的鉴别诊断和疫情监测，在控制、净化和消灭FMD的工作中发挥重大作用。

研究证实3ABC蛋白是FMDV的一种非结构蛋白（NSP），参与病毒RNA复制，仅在FMDV 复制过程中特异性产生，而灭活疫苗在免疫机体过程中不产生此种蛋白的特性，结合我国目前口蹄疫预防主要采用口蹄疫灭活疫苗进行免疫的实际情况，检测FMDVNSP产生的抗体是监测动物感染FMDV的可靠指标。

该ELISA试剂盒利用制备的针对3ABC基因小片段抗原的单克隆抗体，优化阻断ELISA反应体系，建立检测FMDV-NSP抗体的单抗阻断ELISA方法，可同时检测不同种类动物的FMDV 感染抗体。

与其他同类产品相比，该试剂盒具有以下特色：
1、特异性强，能够与目前临床使用的O型、Asia-I型及A型灭活疫苗产生的抗体进行良好的鉴别区分；
2、敏感性高，感染后7-10天即可检测到感染抗体，可检测到的阳性抗体可持续至少9个月以上，既可检出临床发病牛也可检出隐性感染牛；
3、通用性好，可用于所有FMDV易感动物的感染抗体检测。

一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。

现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。

1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。

病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。

中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。

病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。

2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。

灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。

当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。

然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。

中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。

2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。

目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。

硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。

用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别感染动物与疫苗免疫接种动物吉艳红;刘艳红【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2009(030)010【摘要】口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的发生于偶蹄类动物的一种急性、热性传染病,曾多次在世界上发生过大流行.疫苗接种是防控口蹄疫暴发的有效措施之一,而要控制口蹄疫的流行,首先要将病毒感染动物从疫苗接种群体中区分开来.以口蹄疫病毒非结构蛋白(NSPs)为抗原,分别利用口蹄疫病毒非结构蛋白2C、3B、3AB和3ABC作为鉴别诊断抗原,检测动物体内的NSPs抗体,可有效的区分感染动物与疫苗免疫接种动物.目前,许多实验室已展开此项工作的研究,这为防控口蹄疫打下了良好的基础.【总页数】4页(P101-104)【作者】吉艳红;刘艳红【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州,730046【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物 [J], 张润祥;高明春;王君伟2.用口蹄疫病毒非结构蛋白区分注苗动物和自然感染动物研究进展 [J], 毕研丽;沈小燕;才学鹏;从国正;常惠芸3.口蹄疫病毒自然感染和疫苗接种动物鉴别方法研究进展 [J], 任林柱;王兴龙;崔丽瑾4.区分动物疫苗免疫与病毒感染的口蹄疫非结构蛋白3AB鉴别诊断试剂盒的研制[J], 陈波;徐泉兴;卢永干;尤永进;潘洁;朱彩珠;饶钟;陈倍娟;吴永明;顾晓峰;游丕荣5.用口蹄疫非结构蛋白鉴别康复动物与注射疫苗动物的研究及应用 [J], 卢永干因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

检测牛、猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立检测牛、猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立引言口蹄疫是一种广泛存在于全球的病毒性畜禽传染病，对经济和社会产生了严重的危害。

为了控制和预防口蹄疫的传播，建立一种高灵敏度和特异性的口蹄疫病毒抗体检测方法至关重要。

本文旨在建立一种牛、猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB 抗体ELISA方法，并验证其在口蹄疫抗体检测中的可行性和准确性。

材料与方法1. 实验材料本实验使用的材料包括：牛、猪感染口蹄疫病毒的血清样品、抗体（抗牛、猪IgG）、酶标板（ELISA板）、荧光素底物等。

2. 建立抗体ELISA方法的步骤(1) 血清标本处理：采集牛、猪感染口蹄疫病毒的血清标本，离心后取上清液。

(2) ELISA板涂层：将病毒非结构蛋白3AB溶液均匀涂覆在ELISA板上，孵育一定时间，然后洗涤。

(3) 标本孵育：加入稀释后的血清标本到每个孔中，孵育一定时间，再次洗涤。

(4) 探针结合：加入特异性抗牛、猪IgG的辣根过氧化物酶（HRP）探针，孵育一定时间，再次洗涤。

(5) 酶标记物检测：加入荧光素底物并孵育，待反应停止后在特定波长下测量荧光素的发光强度。

(6) 数据分析：根据荧光强度确定样品中口蹄疫病毒3AB 抗体的含量。

结果与讨论通过建立的牛、猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法，我们成功检测到了感染口蹄疫病毒的牛、猪血清样品中的抗体含量。

首先，我们验证了该方法的特异性。

通过检测感染其他病毒的动物血清样本，发现只有感染口蹄疫病毒的牛、猪血清样品中存在具有特异性的抗体反应。

这表明我们建立的ELISA方法对口蹄疫病毒抗体具有较高的特异性。

其次，我们评估了该方法的灵敏度。

采用不同浓度的口蹄疫病毒3AB抗体标准品进行检测，结果显示该方法可以准确测量血清中不同浓度的抗体。

同时，我们还比较了该方法与其他方法的灵敏度，结果显示该方法相比其他方法具有更高的灵敏度。

90猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试剂诊断试剂盒2010年版兽药典三部增、修订品种品名中国兽药典(2010年版三部)猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒[修订] 新增。

猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒Zhu Kou Ti Yi Bing Du Fei Jie Gou Dan Bai Kang Ti Mei Lian Mian Yi Xi Fu Shi Yan Zhen Duan Shi Ji HeSwine Foot And Mouth Disease Virus NS protein-based ELISA Kit 本品系用人工合成的口蹄疫病毒非结构蛋白多肽2372作为抗原包被的抗原包被板与稀释板、阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液、酶结合物及稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液和洗涤液等组装而成。

用于检测猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体。

与猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒配套使用，用于区分口蹄疫野毒感染动物和疫苗免疫动物。

【性状】应密封完好、组分齐全、无破损、无渗漏。

其中：（1）抗原包被板（96孔板）表面光洁、无裂纹、无异物，数量为1块或2块。

（2）稀释板（96孔板）表面光洁、无裂纹、无异物，数量为1块或2块。

（3）阴性对照血清应为淡黄色澄清溶液，无臭、无味、无沉淀物，装量为0.5 ml。

（4）阳性对照血清应为淡黄色澄清溶液，无臭、无味、无沉淀物，装量为0.5 ml。

（5）酶结合物应为淡黄色澄清溶液，无臭、无味、无沉淀物, 装量为0.3 ml。

（6）TMB底物A液应为淡黄色澄清溶液，无沉淀物，装量为7 ml或15 ml。

（7）TMB底物B液应为淡黄色澄清溶液，无沉淀物，装量为7 ml或15 ml。

（8）样本稀释液应为澄清的淡黄色溶液，无臭、无味、无沉淀物，装量为30 ml或45 ml。

（9）酶结合物稀释液应为无色澄清溶液，无臭、无味、无沉淀物，装量为20 ml或30 ml。