第三章 蛋白质的修饰和表达

大肠杆菌表达体系的应用
当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱 氨酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要 翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多 可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。
1．表达载体的一般特点
(1) (2) (3) (4) (5) (6) 复制起始点 选择性基因 强的、可诱导的启动子 强的转录终止序列 核糖体结合位点 合适的多克隆位点
第三章 蛋白质的修饰和表达
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径
一、功能基团的特异性修饰 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
一、功能基团的特异性修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和 的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基 和羧基特别容易产生有用的取代。 因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止 一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况 下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧 基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在 化学上很难将肽链的α-氨基或α-羧基基团与侧链上的氨基 或羧基相区别。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变
2．区域性定向突变
基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也 可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段 取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性 内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序 列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。

第三章 蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要
研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学
途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重
组蛋白质的表达进行讲解。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。

（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。


蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。





（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。

5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前 最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很 强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。

20h
完全水解
碱水解
NaOH (5M) 10-20h
色氨酸稳定
• 缺陷
色氨酸被破坏，部分 丝氨酸、苏氨酸水解， 天冬酰胺和谷氨酰胺 脱酰胺基
大多数aa被破坏，有 消旋作用，产物为D和L-氨基酸混合物； 精氨酸脱氨
酶水解 蛋白酶
无消旋作用， 不完全水解，需多种 aa不被破坏 酶协同作用
完全水解：混合旳氨基酸 部分水解：肽段和氨基酸
• 肽键旳特点
具有部分双键特征，不能自由旋转,呈现相正确刚性和平面化。 肽键旳亚氨基没有明显旳解离和质子化。 除脯氨酸外多以反式构造存在。
• 肽旳化学反应
多肽链旳水解：酸水解、碱水解、酶水解 具有旋光性 颜色反应 紫外吸收
• 天然存在旳主要多肽
• 以蛋白质形式存在: • 以天然活性肽形式存在：
• 生物活性肽
与溶剂分子旳相互作用 溶剂旳pH和离子构成 多肽主链折叠旳空间限制。 蛋白质旳氨基酸序列
四、蛋白质旳二、三、四级构造
• 二级构造
指肽链旳主链在空间旳排列,或规则旳几何走 向、旋转及折叠。
维系力：链内或链间形成旳氢键。
由R基旳短程顺序决定。 主要有-螺旋、-折叠、-转角。 • 几种纤维状蛋白质
-角蛋白 -角蛋白 胶原蛋白
白质含量旳计算基础 2.蛋白质旳生理功能：要点 构成生物体旳基本成份；具有多
种多样旳生物功能
（二）.蛋白质构造
1、肽 2、蛋白质旳一级构造 3、蛋白质旳构象
二级构造 超二级构造和构造域 三级构造 四级构造
（三）肽
一分子氨基酸旳α-羧基与另一分子氨基酸α-氨基脱水缩合旳化合物叫
做肽．肽是氨基酸旳线性聚合物。
相对独立旳三维实体缔合而成三级构造。这种相对独立旳三维实体就称构造 域。存在于一条肽链内。 铰链区 功能域

表观遗传学第三章组 蛋白修饰
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汇报人：
目录 /目录
01
点击此处添加 目录标题
04
组蛋白修饰的 酶类
02
表观遗传学概 述
05
组蛋白修饰的 作用机制
03
组蛋白修饰的 种类
06
组蛋白修饰与 疾病的关系
01 添加章节标题
02 表观遗传学概述
表观遗传学的定义
表观遗传学是研究基因型未发生变化但基因的表达却发生了可遗传变化的科学。 表观遗传学主要关注DN甲基化、组蛋白修饰和非编码RN等对基因表达的影响。 表观遗传学在生物体发育、肿瘤发生和神经科学等领域有广泛应用。 表观遗传学可以通过研究基因表达的可遗传变化来揭示遗传信息与环境因素之间的相互作用。
sirtuins两类具 有不同的生物学 功能和底物特异
性。
研究意义：组蛋 白去乙酰化酶在 多种生物学过程 中发挥重要作用 如细胞分化、肿 瘤发生等是当前 表观遗传学研究
的热点之一。
组蛋白甲基化酶
定义：能够催化组蛋白甲基化反应的酶类
作用机制：通过甲基化组蛋白的特定位点 调控基因的表达
种 类 ： 包 括H MTs 和 HM Ts e 等
研究意义：组蛋 白泛素化在表观 遗传学中具有重 要的研究意义对 于理解生物发育、 细胞分化和疾病 发生机制等方面 具有重要意义。
04 组蛋白修饰的酶类
组蛋白乙酰化酶
定义：组蛋白乙 酰化酶是一类能 将乙酰基团转移 至组蛋白特定位 点的酶
作用：调控基因 表达影响细胞分 化、发育和肿瘤 发生等过程
种 类 ： 包 括 H Ts 和 K Ts 等 不 同 亚 型具有不同的底 物特异性和功能
与其他修饰的关系：组蛋白磷酸化可以与其他修饰如甲基化、乙酰化等相互影响共同参与基 因表达的精细调控。