蛋白质的修饰和表达精品课件

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蛋白质的结构及功能课件.ppt

蛋白质的结构及功能课件
2. 侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
3. 侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
4. 侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
5. 侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸
蛋白质的结构及功能课件
3. 氧化供能
蛋白质的结构及功能课件
第一节
蛋白质的分子组成
The Molecular Component of Protein
蛋白质的结构及功能课件
蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe、
Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还含有 I 。
蛋白质的结构及功能课件
蛋白质的结构及功能课件
第三节
蛋白质结构与功能的关系
The Relation of Structure and Function of Protein
蛋白质的结构及功能课件
一、蛋白质一级结构与功能的关系
（一）一级结构是空间构象的基础
二
硫
键
牛核糖核酸酶的一级结构
蛋白质的结构及功能课件
去除尿素、 β-巯基乙醇
蛋白质的结构及功能课件
生物化学与医学
• 生物化学的理论与技术已渗透到医学科学的各个领域
• 生物化学在生命科学中占有重要的地位 • 生物化学的发展促进了疾病病因、诊断
和治疗的研究
蛋白质的结构及功能课件
本课内容简介（一）
• 蛋白质的结构与功能 •酶 • 生物氧化 • 糖代谢 • 脂类代谢 • 氨基酸代谢
几种特殊氨基酸
Gly：无手性碳原子。 Pro：为环状亚氨基酸。 Cys：可形成二硫键。

蛋白质泛素化修饰的技术路线PPT课件

感染性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对感染性疾病的治疗，一些研究关注利用泛素化系统来抑制病毒或细菌的复制。通过调节泛素化修饰相关信号通路，可以抑制感染进程并改善疾病预后。
04
泛素化修饰的干预手段
药物干预
01
02
03
靶向药物
针对特定蛋白质的泛素化修饰，开发靶向药物，以调节蛋白质的稳定性、定位或功能。
开发泛素化修饰相关药物
基于对泛素化修饰机制的理解，开发能够调节泛素化修饰的药物，用于治疗相关疾病。
THANK YOU
抑制酶活性
通过抑制泛素化修饰相关酶的活性，调控蛋白质的泛素化水平，进而影响其生物学功能。
激活酶活性
激活泛素化修饰相关酶的活性，增加特定蛋白质的泛素化修饰，以调节其生物学行为。
基因治疗
基因敲除
通过基因敲除技术，消除与泛素化修饰相关的基因，从而调控蛋白质的泛素化状态。
基因过表达
过表达与泛素化修饰相关的基因，增加特定蛋白质的泛素化修饰，以调节其生物学功能。
泛素化修饰在神经退行性疾病中的作用
泛素化修饰可以调控神经元的生长、突起和凋亡等过程。在神经退行性疾病中，异常的泛素化修饰可能导致神经元功能障碍和死亡。
神经退行性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对神经退行性疾病的治疗，一些研究关注调节泛素化修饰相关信号通路。通过抑制某些泛素化酶的活性或调节相关信号通路，可以延缓神经元死亡和疾病进展。
蛋白质泛素化修饰的技术路线ppt 课件
目录
• 泛素化修饰概述 • 泛素化修饰的检测技术 • 泛素化修饰相关疾病研究 • 泛素化修饰的干预手段 • 展望与未来研究方向
01
泛素化修饰概述
泛素化修饰的定义

蛋白质翻译及翻译后修饰课件.ppt

1.3 核糖体（ribosome）与核糖体rRNA
核糖体是rRNA 与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放因子（RF）等。
原核的核糖体（70S）= 30S小亚基 + 50S大亚基 30S小亚基: 16S rRNA + 21种蛋白质 50S大亚基: 23S，5SrRNA + 34种蛋白质
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNA的结构—“四环一臂”
倒L形的三级结构
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。 tRNA上至少有4 个位点与多肽链合成有关：即3’CCA氨基酸接受位
点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。每一个氨基酸有其相应的tRNA携带, 氨基酸的羧基与tRNA的 3’
反应如下：
A A t R N A A T P 氨酰基 - t R N A 合成酶 A A - t R N A A M P P P i
氨基酸的羧基与tRNA 的3’端CCA-OH 以酯键相连，因此其氨基是自由的。
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNAfmet fMet-tRNA合成酶
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制
信号肽（signal peptide）是在新生的多肽链中，可被细胞识别系统识别的特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
本章结束
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
氨酰基tRNA进入A位
新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助

高中生物精品课件：蛋白质

CH COOH CH2COOH
② H2N CH2 COOH
③ H2N CH CH2 COOH
H
④ O NH2 C
H2N C COOH H
3、蛋白质的基本组成单位：氨基酸
氨基酸约20种：
甘氨酸、组氨酸、
谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸
缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸异亮氨酸、甲硫氨酸
现有1000个氨基酸，共有氨基1020个。
羧基1050个，由它们合成含有4条肽链
蛋白质中，肽键、氨基、羧基的数目分别
是
996 、24、54
先求R基上的羧基数目1050-1000=50
1000-4
再求总羧基数目
先求R基上的氨基数目1020-1000=20
50+4=54
再求总氨基数目 20+4=24
蛋白质是生命活动的主要承担者。
煮熟的蛋白质改变了结构，变得松散，易于消化。
蛋白质
胃蛋白酶胰蛋白酶
多肽
肠肽酶
氨基酸
7、蛋白质的变性
➢正确的三维结构是蛋白质表现其特有的生物学活性所必需的。
蛋白质的空间结构并不稳定，随着各种条件的变化，空间结构也会发生改变，蛋白质就会失去生物学活性。
➢热变性：如温度的变化，一般当温度超过 40～50℃时，大部分的蛋白质的生物活性会完全丧失。
CH2CH2COOH
甘氨酸
丙氨酸
谷氨酸
氨基酸的结构通式：
R
(1)R基不同、氨基酸不同(约20种)。
(2)每个氨基酸分子至少都含有一个氨
基(-NH2)和一个羧基(-COOH)，并且都有一个氨基和一个羧基连在同一
个碳原子上。

蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt

拖尾"point streaking") 。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。
研究内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样，通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。

《蛋白质技术》课件

ABCD
蛋白质免疫学鉴定
利用抗体与抗原的特异性结合，对蛋白质进行定性和定量分析的技术。
蛋白质结晶学技术
通过蛋白质结晶和晶体衍射技术，解析蛋白质三维结构的技术。
蛋白质纯化与鉴定的实例
血红蛋白的纯化与鉴定
利用凝胶过滤色谱法和亲和色谱法纯化血红蛋白，通过质谱分析和免疫学鉴定技术确定其一级结构和分子量。
《蛋白质技术》ppt课件
CONTENTS
目录
• 蛋白质技术概述 • 蛋白质的提取与分离 • 蛋白质的纯化与鉴定 • 蛋白质的修饰与改造 • 蛋白质技术的未来展望
CHAPTER
01
蛋白质技术概述
蛋白质的定义与功能
总结词
蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能，如催化反应、细胞信号转导、免疫防御等。
挑战
蛋白质结构的复杂性、蛋白质功能的多样性和蛋白质相互作用的动态性等，给蛋白质技术的研究和应用带来了巨大挑战。
机遇
随着科技的不断进步，蛋白质技术的研究和应用领域也在不断拓展，为解决人类面临的健康、环境、能源等问题提供了新的机遇。
蛋白质技术的创新与发展趋势
创新
蛋白质技术的创新主要表现在蛋白质设计和改造、蛋白质相互作用研究、蛋白质组学和蛋白质芯片等领域。
蛋白质修饰与改造的实例
酶的改造
通过化学修饰和基因工程技术改造酶，提高其催化效率和稳定性
。
抗体药物的改造
通过基因工程技术改造抗体，提高其亲和力、特异性和药代动力学性质。
细胞因子的改造
通过基因工程技术改造细胞因子，以降低其毒副作用和提高治疗效果。
CHAPTER
05
蛋白质技术的未来展望
蛋白质技术的挑战与机遇

生物化学课件之蛋白质(共119张PPT)

缬氨酸 valine Val V
亮氨酸 leucine Leu L
异亮氨酸 isoleucine Ile I
苯丙氨酸 phenylalanine Phe F
脯氨酸 proline Pro P
目录
2. 极性中性氨基酸
色氨酸 tryptophan Try W
丝氨酸 serine
Ser S
酪氨酸 tyrosine Try Y
第一节蛋白质是生命的物质基础
一、什么是蛋白质?
蛋白质(protein)是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。
二、蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体重要组成成分分布广：
普遍存在于生物界，动物、植物、微生物主要是由蛋白质构成。
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。
由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
二、氨基酸 —— 组成蛋白质的基本单位
赖氨酸 lysine Lys K
精氨酸 arginine Arg R
组氨酸 histidine His H
目录
几种特殊氨基酸
• 脯氨酸
（亚氨基酸）
半胱氨酸
+
-HH
二硫键
胱氨酸
（二）氨基酸的理化性质
1. 两性解离性质 2. 紫外吸收性质 3. 茚三酮反应
1. 两性解离及等电点
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。

蛋白质的修饰和表达课件

蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质。
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤，简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性底物”。
（二）光亲和标记
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反应程度。
（二）氨基的化学修饰
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
（三）羧基的化学修饰谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺类。
二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性。这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。
（一）亲和标记

蛋白质分子的化学修饰课件

磷酸酶
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质的构象或活性位点，从而调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转导过程中起着关键作用，可影响细胞生长、分化、代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质的稳定性，通过调节蛋白质降解途径来影响细胞内蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋白质的特定位点上，可以调节蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋白质的特定位点上，可以调节蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性

蛋白表达及纯化PPT课件

萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离开。
亲和层析
利用基因工程改造的蛋白质分子上的特定标签与固相载体上的配体结合进行分离纯化。常用的亲和层析包括His-tag亲和层析、GST亲和层析等。
离子交换层析和凝胶过滤层析
与抗体药物的纯化类似，离子交换层析和凝胶过滤层析也可用于重组蛋白药物的进一步纯化和精制。
蛋白质相互作用研究中的纯化应用
02
蛋白纯化方法
沉淀法
盐析法
通过加入高浓度的盐溶液，改变蛋白质的溶解
度使其沉淀下来。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低蛋白质溶解度的原理，使其
沉淀。
聚合物沉淀法
利用聚合物与蛋白质的相互作用，使蛋白质沉
淀。
低温沉淀法
在低温条件下，通过改变蛋白质的溶解度使其
沉淀。
离心法
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将不同大小的蛋白质颗粒分离开。
扩展床吸附技术
将大颗粒的介质填充于柱中，使流动相能够通过吸附作用去除杂质，提高纯化效果。
集成化与自动化技术
集成化分离系统
将多个分离步骤集成在一个系统中，实现连续的分离纯化，提高生产效率。
自动化控制技术
通过自动化控制系统，实现分离纯化的全流程监控和自动调节，减少人为误差和操作时间。

高中化学精品课件：蛋白质

还含有 N 等元素。
2．性质
蛋白质盐析和变性的比较
盐析
变性
蛋白质溶液中加浓含无机盐溶液，会使义其溶解度降低而析
出
蛋白质在某些条件作用下聚沉，丧失生理功能
碱金属、镁、铝等条轻金属盐及铵盐的件浓溶液
受热、紫外线、强酸、强碱、强氧化剂、重金属盐，甲醛、酒精、苯酚等有机物
盐析
变性
体除水分外剩余物质质量的一半。 (2)蛋白质是一类结构非常复杂的化合物，由碳、氢、氧、氮、硫、等磷元素组成。蛋白质的相对分子质量很大，从
几万到几千万。蛋白质属于天然有机高分子化合物。
(3)蛋白质是人体必需的营养物质，成年人每天大约要摄取 60～80 g 蛋白质，才能满足生理需要。组成蛋白质的氨基酸分为必需氨基酸(8 种)和非必需氨基酸(12 种)。 2.有下列六种物质①汽油 ②冰醋酸 ③淀粉溶液 ④蛋白质溶液 ⑤食盐水 ⑥油脂。回答下列问题：
[归纳总结]
蛋白质的盐析与变性比较
(1)蛋白质的盐析属于物理变化，是可逆过程。盐析析出
的蛋白质，加入较多量的水，还会溶解。利用盐析可分
离和提纯蛋白质。化学
不可逆
(2)蛋白质的变性是一种变化，是
的。这种变
化使蛋白质的化学组成或空间结构发生变化，因而生理功
能会随之改变。
[活学活用]
1.下列关于蛋白质的叙述中正确的是
实质
物理变化 (溶解度降低)
化学变化 (结构、性质改变)
过程
可逆
用途
分离，提纯蛋白质
不可逆杀菌，消毒等
1.根据已学知识和生活常识，回答下列问题： (1)蛋白质是生命存在的一种形式。蛋白质广泛存在于生

蛋白质表达PPT课件

利用蛋白质表达技术，可以调控特定蛋白质的表达，为生物治疗提供新的策略和方法，如基因治疗、细胞治疗等。
提高蛋白质表达产量的方法与策略
01
优化基因序列
通过优化目的基因的序列，如提高启动子活性、调整密码子使用等，可
以提高蛋白质的表达水平。
02
宿主细胞选择与改造
选择合适的宿主细胞，并进行必要的改造，如细胞代谢途径的优化、细
蛋白质降解
通过细胞内的蛋白酶体系统降解蛋白质，调节细胞内蛋白质的平衡和功能。
02
蛋白质表达系统
原核表达系统
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌表达系统能够高效表达外源基因，
产生大量的重组蛋白质。
操作简便
原核表达系统相对简单，遗传背景和培养条件较明确，便于实验操作和基因工程改造。
表达产物易纯化
原核表达产物通常以可溶性或包涵体的形式存在，易于分离和纯化。
酵母表达系统在工业生产中具有一定的应用价值，可以用于生产酶制剂、生物材料等。
培养基廉价易得
表达量不稳定
酵母菌可以在相对简单的培养基中生长繁殖，降低了生产成本。
酵母表达系统的表达量可能受到多种因素的影响，如基因拷贝数、整合位点等，导致表达量不稳定。
昆虫表达系统
高效表达外源基因
昆虫表达系统如杆状病毒表达系统能够高效侵染昆虫细胞，并在短时间内获得
基因转染技术
基因转染技术是一种将外源DNA或RNA导入细胞的技术。通过基因转染技术，可以将目的基因导入到细胞中，实现目的基因的表达。
基因转染技术是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因转染技术可以将目的基因导入到各种类型的细胞中，如原代细胞、干细胞、肿瘤细胞等，实现目的基因的表达和功能研究。

蛋白表达及纯化ppt课件

蛋白表达及纯化
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。

蛋白诱导表达分子生物学实验精品课件

• 细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子
• 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译
• 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA,
• 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏
• 缺乏翻译后加工体系
• 不溶性的包涵体
最新 PPT
7
在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大
• 目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制 • 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导 • 充分诱导:
最新 PPT
3
蛋白表达操作达载体
1. 酶切, 去磷酸化
2. 胶回收纯化
制备目的DNA
1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切
3. 胶回收纯化
将目的DNA 克隆到载体上 1. 目的片断与载体连接 2. 转化非表达型宿主菌
3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒提取酶,测序确定阅读框
最新 PPT
5
蛋白质表达系统
原核表达系统
大肠杆菌
简单,便宜,大量,无修饰枯草芽胞杆菌
真核表达系统
复杂,昂贵, 有修饰
YEAST CELL CULTURE INSECT CELL TRANSFERRED GENE
最新 PPT
6
9.1.2 原核表达的特点
大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物
学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。
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24
实验关键点
诱导和取样时要进行无菌操作。制备样品时,细菌培养基上清除
干净,且要充分悬浮。每个时间点的样品要立即制样
并做好标记。
最新 PPT
25
思考题

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最新 PPT
2
影响化学修饰的主要因素有两方面：
1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢键和静电作用等，基团之间的的空间阻力。
2、修饰剂的反应活性。
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3
一、蛋白质侧链的化学修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。
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12
3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰反应，但可以和二羰基化合物发生反应。
最新 PPT
13
4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一
性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反应。
最新 PPT
24
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤，简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
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25
酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋法、共价结合法去实现。
1、交联法
是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。
常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2， 2-二磺酸。
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需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统，可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
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1、制造突变体
（1）易错PCR 基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某
些组分的数量或质量，随机引入原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
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（二）定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。
2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低温缓冲液中进行
3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团副反应尽可能少
4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。
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第二节蛋白质的分子生物学改造
蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。
还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解。
修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少。
这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长。
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修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG 可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反
应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与 PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和羧基。
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（二）光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。
反应一般分两步进行：第一步，试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合；第二步，光照，试剂被光激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应。
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三、蛋白质的聚乙二醇修饰
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2、共价结合法
是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，以固定酶的方法。
常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
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影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团
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噬菌体展示技术
是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。
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2、筛选
（1）表型观察选择和筛选菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平
板上产生清晰的水解圈。
在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下，根据菌落周围地物的颜色变化来筛选耐高温的木聚糖酶。
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（2）高通量筛选方法
噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交系统等。
具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。
野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。
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1、重叠延伸PCR技术
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另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性底物”。
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交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3）吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能集团偶联酶蛋白。
关键在于选择适当的突变频率。一般目标基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变结果最理想。
由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果，因此常用连续易错PCR方法。
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DNA shuffling allows accelerated evolution of genes
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四、蛋白质的化学交联和化学偶联
化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间，也可发生于多个分子之间，而形成网状交联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。如戊二醛
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质。
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2、快速定点突变首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂
盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反
向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防止重新氧化成二硫键。
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（五）其他侧链基团的修饰
1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。
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2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修饰，也可以是芳香环上的取代反应。
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5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前
最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反应程度。
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（二）氨基的化学修饰
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重组蛋白质的表达进行讲解。
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第一节蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改变的过程。
有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性，这些修饰称为非必需部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构的改变将导致生物活性的改变。
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
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（三）羧基的化学修饰谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺类。
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（四）二硫键的化学修饰
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5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧化。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性。这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。
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