免疫荧光技术
荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
有关荧光的基本知识
一、荧光现象
（一）荧光的产生
一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。
荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间消失。
可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率
荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。
（三）荧光的猝灭
荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。
二、荧光物质
（一）荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：
有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
2．四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
（二）其他荧光物质
1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长围宽，发射光波长围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
免疫学基本常识：抗原、抗体及单克隆抗体
众所周知，人或动物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵袭，也有一些疾病可以通过机体自身调控而自愈，这是因为机体部存在一个免疫系统。免疫系统是由中枢免疫组织（骨髓、胸腺、消化系统免疫组织）和外周淋巴组织（淋巴结和脾脏）的免疫活性细胞（B淋巴细胞、浆细胞），以及由它们产生的多种淋巴因子和抗体所组成。免疫系统对外来物质产生一系列反应的过程称为免疫，而这种反应本身则称为免疫应答。能够在机体中引起特异性免疫应答的物质称为抗原，免疫应答的结果则是刺激机体产生与抗原相对应的特异性抗体和引起细胞免疫。
由于免疫应答同时取决于机体，而不仅是进入机体的物质，所以抗原的定义是相对的。由此，按照免疫应答的效果可以将抗原分为完全抗原和半抗原：完全抗原是指能够直接诱导机体产生特异性免疫应答的一类物质。完全抗原的分子量都大于5000，其化学成分多为蛋白质或脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖体，多肽，核酸等也都是完全抗原。半抗原能与抗体特异性结合，但不能激发机体产生抗体，必须与蛋白质（载体）结合后进入机体，才能产生有效的免疫应答。大分子的半抗原在体外能与对应的抗体结合发生可见反应（凝集、沉淀），小分子的半抗原能与对应抗体结合而不出现可见反应。此外，抗原还可以按照自身的物质属性分为可溶性（毒素、异种蛋白）或颗粒性（细菌、细胞）抗原，或按临床意义分为外源性和源性抗原。
抗体是在抗原刺激下机体免疫应答的产物。所有抗体都具有与抗原特异性结合的能力。抗体的化学本质是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不过只有当免疫球蛋白针对已知抗原时，才能够称这种免疫球蛋白为抗体。免疫球蛋白属于结构牢固的分子物质，可以经受较大变化的环境作用，诸如56℃加温，在室温下较长时期的贮藏，短期高或低pH处理，甚至与去污剂或尿素接触后仍保持其抗体活性。
抗体活性是指与抗原特异性结合的能力，即二者之间的特殊亲合力。两者非共价键结合，结合的力包括氢键，静电力，德华力和疏水结合力。抗体抗原之间的反应是可逆的，在适宜的条件下仍可解离而性质不变。
机体约有1亿种不同的B淋巴细胞，每个独立的B淋巴细胞只能接受一种抗原的刺激从而形成分泌一种抗体的能力，因此特异性是免疫应答的特有标志。如常识所见，麻疹患者
愈后即获得对麻疹的终生免疫，而这并不形成对天花的免疫。抗体抗原特异性结合的本质是抗原决定簇与抗体结合簇的专一适配性，抗原决定簇是指抗原分子上专有的化学基因，可以决定其刺激机体所产生抗体的特异性。抗原决定簇与其相对应的抗体结合簇立体构型完全相适应。一个抗原分子可带有多个不同的决定簇。抗原分子量愈大，决定簇数量愈多。决定簇数目代表抗原分子的价。抗体结合簇是在抗体分子上与对应的抗原决定簇发生特异性结合的部位，位于Ig分子的抗原结合分段（V段）上，由重链和轻链的一部分可变区构成。其特异性由氨基酸排列顺序决定，约包括5～15个氨基酸。每个单体免疫球蛋白分子如IgG有2个结合簇，IgA是二聚体，有4个结合簇，IgM是五聚体所以有10个结合簇。(但是，事情并不是绝对的。一种抗体除与相对应的抗原发生特异性反应外，也有可能与化学结构部分相似的其它抗原发生反应，这就是通常所说的交叉反应。交叉反应可能由于两种抗原有共同的决定簇，或由于两者的抗原决定簇虽然不完全相同，但在立体化学结构上密切相关，导致一种抗原能与另一种抗原的对应抗体结合。)
正常情况下，抗体与抗原在机体结合后，可以被吞噬、排泄而将抗原清除。如果这种抗原属于外源性致病抗原（细菌、病毒、毒素），可以由此达到杀灭或削弱抗原危害的目的。对于源性抗原，如已经衰退、损伤或突变的异常细胞，也能被及时排除，实现机体自身的免疫调控。当然，在异常情况下，抗体抗原结合后形成的免疫复合物将损伤组织、细胞，引起花粉过敏一类的变态反应或免疫性疾病等不良后果。
不过长期以来所谓特异性免疫血清抗体，不论是从人还是从动物获得的，也不论是主动获得还是被动获得的，实际上都是有许多种具有不同特性的抗体所组成的混合抗体。这是因为，进入机体的抗原往往带有若干个抗原决定簇。此外，不同个体对同一抗原决定簇的反应并不相同，即使同一个体不同时间接受抗原刺激后产生的反应也不完全一致。由于人们无法将体已受抗原刺激的各种不同的B淋巴细胞克隆区分开，即使在体外能将它们分成单细胞，也无法让其继续生长，增殖并分泌抗体。因此，用常规免疫方法制备的免疫血清抗体只能是数目众多的单克隆抗体的混合物，现在，一般称其为多克隆抗体（PcAb）。这种多克隆抗体存在特异性差、效价低、数量有限、动物间个体差异大，难以重复制备等固有缺陷，许多场合下使用时难尽人意。
1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein合作发表了题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”的著名论文（Nature,256:495,1975）。他们将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快
速增殖，又能持续地分泌特异性抗体，通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系，由此单克隆系就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（McAb）。上述方法创立了一项具有划时代意义的新技术－利用B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体。这一技术的创立和迅速推广，为所有需要制备和使用抗体的研究领域提供了全新的手段和制剂，促进了生命科学诸学科的发展。两位科学家也由于这一杰出贡献荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。
黄曲霉毒素B1是一种二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，分子量为312，属于半抗原，不能直接诱导机体产生免疫应答。因此我们的工作首先是将黄曲霉毒素B1与载体蛋白连接，合成为完全抗原，以后的研究则基本上采用了前述杂交瘤－单克隆抗体技术的经典方法：动物免疫→免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合→细胞筛选→用有限稀释法分离出可分泌特异性抗体的单个细胞，再经过克隆化培养建立杂交瘤细胞株并制备出大量单克隆抗体，从而在此基础上最终建立了黄曲霉毒素B1（AFB1）的免疫检测方法。
免疫标记法
（一）荧光免疫法：
原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
（二）放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
(三) 酶联免疫法(ELISA)
ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性围达1 000ug／L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
以双抗法为例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—抗体复合物。最后加入底物，由酶催化底物生成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。
（四）偶联生物素—亲和素系统的酶免法
利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
（五）时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极提高了分析灵敏度。
(六) 解离增强镧系元素荧光免疫分析
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
免疫细胞化学常用试剂介绍 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
第八章荧光免疫技术 FluoreSCenCe ImmunoaSsay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术 的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。 二、教学内容 1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。 2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体 D．间接检测抗原或抗体 E．间接检测抗原和抗体 2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃ D．25～30℃ E．30～35℃ 3．荧光抗体保存3～4年，应选择 A．小量分装、4℃ B．瓶分装、4℃ C．瓶分装、-10℃ D．瓶分装,-20℃ E．小量分装、-20℃ 4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A．光源 B．聚光器 C．目镜 D．物镜 E．滤光片
5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型 A．直接法 B．夹心法 C．间接法 D．补体法 E．双标记法 6．荧光抗体染色标本的观察时间 A．当天 B.第二天 C．第三天 D．1周内 E．5天 7．荧光抗体闭接法应标记 A．抗原 B．抗体 C．补体 D．抗抗体 E．抗体及补体 8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是 A．直接法 B．间接法 C．双抗体夹心法 D．补体法 E．双标记法 9．荧光抗体间接法可检测 A．抗原 B．抗体 C.补体 D．蛋白质 E．抗原和抗体 lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是 A．抗原荧光染色 B．抗体荧光染色 C．补体荧光染色 D．特异性荧光染色 E．非特异性荧光染色 11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术 A．荧光偏振免疫测定 B．荧光免疫显微技术 C．时间分辨荧光免疫测定 D．底物标记荧光免疫测定 E．流式荧光免疫技术 12．临床药物浓度检测的首选方法
直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 试剂与仪器 l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） l 荧光显微镜 l 玻片架 l 滤纸 l 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。 3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++
--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 注意事项 1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 （1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 （2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 （3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫细胞化学与图像分析 在细胞生物学中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量测量信息。在免疫细胞化学中也存在同样的问题。制作免疫细胞化学标本环节较多，只要有一个环节失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成了理想的标本后，如何进行观察，才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本章的编写目的。 一、定量分析的重要性 目前有许多研究免疫细胞化学的文章，是做定性和定位研究的。如有文献中提到，P物质在脑组织中存在于30处以上，这只是解决了定性定位问题，这些部位含P物质的量是否相同？可否用快速简便的方法对细胞内免疫反应产物的量进行分析？从而可进行比较。所谓反应产物的“量”包括颜色深浅，其所占的长度或面积等，就要借助于图像分析仪（image analyzer）了。 以往我们对免疫细胞化学或一般组织化学光镜标本的观察，对反应产物的量常用“+”号表示，一般可分为0～+++，共五个等级，这种方法对差别较大的标本当然还是可以用的，但存在以下三方面的问题：①同一张标本，不同的观察者可以得到出不同的结论，因为这种分级没有明确的客观标准；②即使同一张标本同一个观察者，间隔若干天后进行再次观察时，可能结论也不一样的；③最后一点也是最重要的一点，人的视觉是有一定限制的，用一般观察法实际上已经丢失掉了许多可贵的信息，因为你察觉不到实际上存在的较小的差异。因此我们力求有一个客观的比较精密的标准。除了常用的仪器如显微分光光度计(microspe ctrophotometer)和显微密度计（microdensitometer）等以外，还可用图像分析仪进行测量。前二者已有许多有关著作中介绍过，就其精确与灵敏来说都是够的，但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其他极有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多，并能明显地提高工作效率，所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理，只要将各种统计学公式输入计算机，选择其中你所采用的公式，即可快速得出分析结果，告诉你有无显著性差异。 二、图像分析仪简介 图像分析仪又称图像分析系统（image analysis system），主要用来解决如何客观地较精确地用数字来表达存在于标本中的各种信息，可称为数学形态学。它已经成为一种公认的科学研究工具，并且逐渐展现出巨大的潜能。图像中包含着极其丰富的内容，是人们从客观世界中获得信息的重要手段，因此，正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课题，并广泛应用于航空遥感测量、金属图像测量、微电子技术
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
免疫组织化学技术（ABCxx） 大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和 0.03%H 2O 2的 0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含 0.03%DAB 和 0.006%H 2O 2 的Tris 盐酸缓冲液（pH 7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。 鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P< 0.01。比例尺为100 am。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P< 0.01。 免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。 HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和 B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。 比例尺为20 am。 细胞进行处理后,弃培养基,用 0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。 加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体 (1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次 10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用 488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。
Luminex的基本原理及应用 传统的蛋白质分析主要采用双抗体夹心ELISA法。此法长期以来被视为蛋白质定量分析的“标准方法”。ELISA可以用来准确测定大批量生物样品，但每次实验只能分析一个目标分子，而不具备同时分析多种目标分子的能力。在ELISA基础上发展出的 luminex技术，不仅同样通过双抗体选择而具有高特异性，同时也具有ELISA的高通量、操作简便、测量准确等优点，而且可以在一次实验中完成对多种目标分子的分析，从而改变了过去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平台。Luminex技术原理，在近年发表的文章中已有过详细的介绍和说明。Luminex 技术应用微球和流式细胞仪的原理。微球内部含有三种荧光免疫荧光，通过荧光不同的比例可以区分500种不同的微球。每种微球可以用来检测一种不同的蛋白或基因。因此，利用微球技术，可以同时检测高达500个蛋白或基因。该技术利用荧光编码的微球共价交联单克隆抗体，与被测定的目标分子结合后，加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和测量“检测荧光”强度来确定被测分子的浓度。在使用相同抗体对的条件下，luminex技术的测量结果在准确度、精确度、灵敏度方面与ELISA均可达到相似的水平。Luminex应用的荧光编码微球带有针对不同目标分子的特异性抗体，不同的微球在一定程度上可以自由组合，这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。多目标分子的同时测定可以大大减少生物样品的消耗量，节省成本和测定时间，并且使多种目标分子之间相关性的分析更加准确。很多公司已经开始提供Luminex试剂盒，用于基础和临床医学研究以及临床检测。目前，Luminex 试剂盒已经可以检测500多种蛋白质分子，包括细胞因子、激素、自身抗体、肿瘤标志物等。 Luminex常见问题及解答 LUMINEX应用于哪些领域? 生物医学研究，生物标记物开发，临床检测等领域。Luminex技术主要用于蛋白和核酸检测分析。 LUMINEX敏感性如何？ 灵敏度取决于开头的质量。对于同样的抗体对，Luminex检测的灵敏度高于ELISA技术。一般检测灵敏度在pg级。 对不同类型的样品制备和样品量的要求是怎样的？ 血清、血浆是常用的样本，每次检测需要10ul，每次可以检测多个蛋白。 从各种细胞或组织中提取的蛋白也可以用Luminex技术检测，制备方法与ELISA、Western Blot完全一样。 一般可以检测到多少基因或蛋白的表达信息？ 检测蛋白和基因的数目主要取决于试剂盒。蛋白质检测目前最高可以达到50个左右，基因检测最高达500个。 如何保证检测结果的特异性？ 检测的特异性取决于抗体高特异性。试剂几乎全部来源于美国大公司，产品经过了严格的质量控制。同时，我们检测公司也有近15年的经验、严格的操作程序和质量控制体系。 客户自己提供抗体，是否可以进行LUMINEX检测？ Luminex和ELISA检测试剂都需要两个配套的特异性抗体。我们公司具有开发Luminex试剂盒的经验。但是，需要一系列的开发工作才能保证结果的特异性、重复性和可靠性。 除了蛋白，LUMINEX技术是否还可以用于其它指标的检测？ 可以用于基因表达，基因多态性和HLA配型分析。
免疫组织化学技术题 库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.doczj.com/doc/bf10026434.html,/)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是（）. A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确 上述均为免疫标记电镜的成功关键。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态（）. A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对 氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC) General Procedure: i Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature. ii Rinse coverslips well with sterile H2O (3 times 5 min each). iii Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hrs. iv Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation. v Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS). Fixation: 1. Fix the samples either in ice-cold methanol, acetone (1-10 min) or in 3-4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 15 min at room temperature. 2. Wash the samples twice with ice cold PBS. Permeabilization: If the target protein is expressed intracellularly, it is very important to permeabilize the cells. Note: acetone fixed samples do not require permeabilization. 3. Incubate the samples for 10 min with PBS containing 0.25% Triton X-100 (or 100 μM digitonin or 0.5% saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate for the use of membrane-associated antigens since it destroys membranes. 4. Wash cells in PBS three times for 5 min. Blocking and Incubation: 5. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species that the secondary antibody was raised in). 6. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C. 7. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash. 8. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in dark. 9. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in dark. Counter staining: 10. Incubate cells on 0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min. 11. Rinse with PBS. Mounting: 12. Mount coverslip with a drop of mounting medium.
免疫荧光组织化学技术 一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述…………………………………………………… 二、免疫荧光组织化学的原理………………………………………………………………… （一）直接方法…………………………………………………………………………… 1．检查抗原方法…………………………………………………………………… 2．检查抗体方法…………………………………………………………………… （二）间接方法…………………………………………………………………………… 1．检查抗体(夹心法)方法…………………………………………………………… 2．检查抗体方法…………………………………………………………………… 3．检查抗原法……………………………………………………………………… （三）补体法……………………………………………………………………………… 1．直接检查组织内免疫复合物方法……………………………………………… 2．间接检查组织内抗原方法……………………………………………………… （四）双重免疫荧光组织化学标记方法………………………………………………… （五）对照试验…………………………………………………………………………… 1．直接方法………………………………………………………………………… 2．间接方法………………………………………………………………………… 3．补体方法………………………………………………………………………… 三、荧光抗体的制备……………………………………………………………………………… （一）荧光素……………………………………………………………………………… 1．异硫氰酸荧光素………………………………………………………………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明………………………………………………………… 3．得克萨斯红(Texas red)…………………………………………………………… 4．其它荧光素………………………………………………………………………… （二）荧光素标记抗体的方法…………………………………………………………… 1．FITC标记抗体的方法…………………………………………………………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法…………………………………………… 3．藻红蛋白标记抗体方法…………………………………………………………… 4．蓝色荧光素标记抗体方法………………………………………………………… （三）荧光抗体的质量控制……………………………………………………………… 1．染色特异性和敏感性的测定方法………………………………………………… 2．F/P比值的测定方法……………………………………………………………… 3．荧光抗体的保存…………………………………………………………………… 四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………