细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用

中国组织工程研究与临床康复筹７４孝第４５躬　２０１０—１１—０５出版　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｒｅｈａｂ　ａｔ　ｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　ｓ　２０１０　ＶｏＬ　１４．Ｎｏ．４５　细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用木　何亚芳，陈惠金，钱龙华，陈冠仪　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｏＩｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　Ｈｅ　Ｙａ－ｆａｎｇ，Ｃｈｅｎ　Ｈｕｉ－ｊｉｎ，Ｑｉａｎ　Ｌｏｎｇ－ｈｕａ，Ｃｈｅｎ　Ｇｕａｎ—ｙｉ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏ　Ｐｅｄｉａ仃ｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｘｉｎｈｕａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａ币ｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ～　ＳｃｈｏｏＩ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００９２，　Ｃｈｉｎａ　Ｈｅ　Ｙａ－ｆａｎｇ．　Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒ－ｉｎ，　ｔｒａｉｎｉｎｇ．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ。Ｘｉｎｈｕａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ＳｃｈｏｏＩ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００９２，Ｃｈｉｎａ　ｙｆｒ１３１４＠１６３　ｃｏｒｎ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｔｏ：　Ｃｈｅｎ　Ｈｕｉ－ｊｉｎ．Ｍａｓｔｅｒ，　Ｃｈｉｅｆ　ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，　ＤｏｃｔｏｒａＩ　ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｐｅｄｉａ”ｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｘｉｎｈｕａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ＳｃｈｏｏＩ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００９２．　Ｃｈｉｎａ　ｈｊｃｈｅｎｋ＠ｏｎｌｉｎｅ　ｓｈ　ｃｎ　Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ：ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａＩ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆＣｈｉｎａ　Ｎｏ　３０６７２２４６＊　Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１０．０６．０８　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０１Ｏ一０８—１６　８３９４　ＢＡＣＫＧＲｏＵＮＤ：Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｈａｖｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．ｈｏｗｅｖｅｒ．ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕＩａｒ　Ｉｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ（ＰＶＬ）　ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｐ０ｐｏＩｙｓａｃｃｈａ—ｄｅ（ＬＰＳ）．ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ—ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ．　ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａｓ　ａｎｄ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｗｏ．ｄａｙ—ｏｌｄ　Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｊｎｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｏｎｔｒｏＩ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＬＰＳ　ｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＬＰＳ（１　００　ｐｇｌＬ）　ｆ０ｒ　４８　ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｎｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ—ｄｅｏｘｉｄｉｚｅ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ｌｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｉｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｆＯ２一）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｄｅｏｘｉｄｉｚｅ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ｔｈｅ　Ｉｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（ＯＮＯＯ。）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔ￣．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｄｅａｔｈ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａＩ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．　ＲＥＳＵＬＴＳ　ＡＮＤ　ＣＯＮＣＬＵＳｌＯＮ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．ｔｈｅ　Ｉｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ。Ｏ２　ａｎｄ　ＯＮＯＯ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＬＰＳ　ｇｒｏｕｐ．ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ．１ｔ　ｉｓ　ｖａｌｉｄａｔｅｄ／ｎ　ｖ＃ｒｏ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅａｔｈ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ＬＰＳ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ—ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ｔｏ　０ｌｉｑ０ｄｅｎｄｒＯｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ｉｎ　ＬＰＳ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｉｍｐｅｌｓ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ａｃｔｉｖａｔｅ　ＮＡＤＰＨ　ｏｘｉｄａｓｅ，ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　０２一，ｗｈｉｃｈ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｆｏｒｍｓ　ＯＮＯＯ．ａ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｔｏｘｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ．ｆｉｎａｌｌｙ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅａｔｈ．　Ｈｅ　ＹＦ，Ｃｈｅｎ　ＨＪ，Ｑｉａｎ　ＬＨ，Ｃｈｅｎ　ＧＹ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｉｐ０ｐＯＩｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｇｌｉａ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｉｌｓ：　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｕｄｙ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕｚｈｉ　Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ　Ｙａｎｊｉｕ　ｙｕ　Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ　Ｋａｎｇｆｕ．２０１０；１４（４５）：８３９４—８３９８．　【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｃｎ　ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】　摘要　背景：已有实验证实，脑白质病变如多发性硬化症和脑室周围自质软化等一些神经病变的发病机制，均涉及到局部小胶质细　胞的激活。　目的：探讨细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用。　方法：取２　ｄ龄ＳＤ大鼠脑内小胶质细胞和少突胶质细胞前体共培养，分为共培养对照组和共培养脂多糖组。对共培养细胞　经脂多糖１００　ｐｇ／Ｌ诱导４８　ｈ，分别应用硝酸还原比色法检测一氧化氮含量，还原．比色法检测超氧阴离子含量，免疫细胞染　色法检测过氧亚硝酸盐含量，Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２／ＰＩ荧光染色法观察细胞死亡的形态学改变，以及流式细胞仪检测细胞成活率。　结果与结论：与共培养对照组比较，脂多糖诱导导致共培养细胞内一氧化氮、超氧阴离子、过氧亚硝酸盐含量均明显增加，　少突胶质细胞前体的凋亡率亦显著增加。通过体外观察，确认脂多糖诱导少突胶质细胞前体的死亡通路，是由于脂多糖诱导　小胶质细胞激活，导致小胶质细胞表达一氧化氮合酶和活化ＮＡＤＰＨ氧化酶，致使其产物一氧化氮和超氧阴离子大量生成，　两者进一步反应生成大量的毒性因子过氧亚硝酸盐，作用于少突胶质细胞前体，从而导致少突胶质细胞前体的死亡　关键词：少突胶质细胞前体：小胶质细胞：脂多糖：过氧亚硝酸盐：毒性作用　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７３－８２２５．２０１０．４５．００９　何亚芳，陈惠金，钱龙华，陈冠仪　细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用【Ｊ】．中国组织丁程研究与　临床康复，２０１０，１４（４５）：８３９４－８３９８．　【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ　ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】　Ｏ　引言　近年来，流行病学资料和实验动物研究均　显示，感染炎症在脑室周围白质软化　ｆｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ，ＰＶＬ）的发病机　制中占了相÷‘ｊ比例【］　Ｊ。脂多糖是细菌外膜的主　要构成成分，具有强力的自然免疫诱导活性。　动物实验中，对新生小猫全身应用脂多糖，或　对新生大鼠肭内、子宫内或通过胎盘注射脂多　糖，均可产生与人类早产儿相似的脑白质损伤。　临床上母亲炎症或胎儿中枢神经系统感染，其　新生儿出生后脑瘫的发生率可明显增加　Ｊ。　小胶质细胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ，ＭＧ）是中枢神经系　统常驻的巨噬样细胞，对免疫攻击反应高度敏　感，在中枢神经系统的先天免疫反应中发挥核心　作用，是脑内抵御病原微生物和损伤的第一道防　线　。正常情况下，腑内ＭＧ处于静止状态，主　要起营养支持作用，并通过细胞外基质成分、可　溶性因子的释放以及细胞与细胞间的连接，促进　神经元亚单位的迁移以及轴突生　ⅢＪ。当脑组　织受到炎症、感染等的刺激时，ＭＧ很快转化为　ＲＯ．Ｂｏｘ　１２０＆Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｃｎ　ｚｇｌｃｋｆ．

ｃｏｍ　伺砭芳　等　细菌鞲多糖诱导话性小皎露细瞻对少突皎碾镪匏裁体的毒牲作甬　激活状态，并执行其天然免疫功能，包括炎症　的诱导，细胞毒性作用以及通过抗原提呈作用　对Ｔ细胞反戍的调节等【１１．’　。激活的ＭＧ释放炎　性因予，如肿瘤坏死因予ａ、ｖ，白细胞介素１，　６等，并生成活性氧和活性　协¨】。尽管激活的　ＭＧ对于抵御外源性的攻击起到一定的作用，但　过度激活常常伤及无辜，介导周围细胞如神经　元或神经胶质细胞的损伤甚至杀死细胞。　相关实验显示，感染冈素诱导小胶质细胞　激活，可导致少突胶质细胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ，　ＯＬ）前体的死亡，而由一氧化氮和Ｏ２反应后所　生成的过氧亚硝酸盐（Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ，ＯＮＯ０一）则　被认为是导致ＯＬ前体死亡的主要毒性因子Ｉ　Ｊ。　应用选择性的抑制剂或清除剂除去一氧化氮和　Ｏ２一，均能显著抑制脂多糖诱导的ＯＬ前体凋　；　而应用特异的ＯＮＯ０　分解催化￣ＩＪ（ＦｅＭＰＹＰ），　在不影响…氰化氮含量的条件下，则能完全阻　断脂多糖诱导的ＯＬ前体凋亡【　。Ｃｚａｐｓｋｉ￣．［’７】　比较了炎症条件下３种…氧化氮合酶的表达和　活力，发现…’氧化氮合酶足病理条件下一’氧化　氮的主要来源。分离ｆ…氧化氮合酶缺失小鼠　的小胶质细胞，在受到脂多糖诱导刺激后，不　能表达…氧化氮合酶和产生ＮＯ。ＮＡＤＰＨ氧化　酶在小胶质细胞为’一种静止酶，其组合元件分　散在细胞质和细胞膜上，在小胶质细胞被激活　后，位＿ｒ其细胞质的元件（Ｐ４０ＰＨＯＸ、　Ｐ６７ＰＨＯＸ）等可移位到膜上，和膜相关元件　（Ｐ９１ＰＨＯＸ、Ｐ２２ＰＨＯＸ）集合，形成活性的酶　复合物，从而催化活性氧和过氧化物的生成。　Ｌｉ等【１　用高度纯化的培养细胞，发现小胶质细　胞是唯…表达包膜ｇｐ－９１和胞质ｇｐ一６７成分的细　胞。用脂多糖刺激缺失ｇｐ．９１的小胶质细胞，并　不能表达活化的ＮＡＤＰＨ氧化酶，也不能检测到　明显升高的超氧『ｊＪｊ离了。因此，…氧化氮合酶　和ＮＡＤＰＨ氧化酶足生成一氧化氮和超氧阴离　子的主要分子来源。感染因素诱导小胶质细胞　激活，促使…氧化氮合酶表达上调￣［ＩＮＡＤＰＨ氧　化酶激活，是导致ＯＬ前体死亡的关键原因，其　产物一氧化氮和超氧阴离子反应所生成的　ＯＮＯＯ。则是导致ＯＬ前体死亡的直接毒性物质。　近年来，母胎感染，炎症导致ＰＶＬ的感染学　说正在得到普遍认可。在感染诱导ＭＧ激活、导　致ＯＬ前体死亡的通路中，由一氰化氦合酶产生　的一氧化氮和由ＮＡＤＰＨ氧化酶产生的超氧阴　离子，两者反应所生成的ＯＮＯＯ‘，被认为足导　致ＯＬ前体死亡的主要毒性因予Ｉ　剐。实验在成　功制备、纯化和培养ＯＬ前体和ＭＧ的基础上二，　应用细蒲脂多糖对共培养ＯＬ前体￣１］ＭＧ进行诱　导刺激，以期通过体外研究对脂多糖诱导活性　ＭＧ导敛ＯＬ前体的死亡通路进行确认。　１材料和方法　设计：动物实验，体外观察。　时间及地点：于２００８—０８／２００９－０２在上海　变通大学医学院附属新华医院中心实验室完　成。　材料：取出生２　ｄ的健康ＳＤ新生大鼠２００　只，雌雄不限，清浩级，购白上海西普尔一必　凯实验动物公司，动物生产许可证号：ＳＣＸＫ　（沪）２００３—０００２；动物使用许可证：ＳＹＸＫ（沪）　２００３—００３。实验过程中对动物的处置符合动物　伦理学标准Ｉ１９］。　主要仪器及试剂：　试剂及仪器　来源　ＤＭＥＭ，Ｆ１２高糖培养基　胎牛血清（ＦＢＳ）　脂多糖、多聚赖氨酸及其它细胞　培养试剂　ＦＩＴＣ．ＩＢ４单克隆抗体　一氧化氮检测试剂盒　一氧化氮合酶多克隆抗体　０４单克隆抗体　抗３－ＮＴ多克隆抗体　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＰＩ　Ｔｒａｎ￣ｅｌｌ共培养系统　美国ＧｔＢＣＯ公司‘　美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司　美国Ｓｉｇｍａ公司　美国Ｖｅｃｔｏｒ公司　南京建成生物研究所　美国Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ公司　美国Ｒ＆Ｄ公司　美国Ｕｐｓｔａｔｅ公司　美国Ｂｅｎｄｅｒ　上海吉泰生物科技　有限公司　方法：　ＭＧ和ＯＬ前体的共培养、脂多糖诱导及分组：　取培养２　ｄ的新生人鼠ＭＧ和ＯＬ前体，在　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培养系统中进行共培养，将ＭＧ）Ｊ［Ｉ　入Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室，ＯＬ前体加入下室。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　上下室之问有…层孔　为０．４　ｕｍ的半透膜相　隔，共培养的上卜室细胞之问没有物理接触，　但营养成分可以自由通过。分为共培养对照组　和脂多糖组：脂多糖组在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室内加入　内加入脂多糖１００　ｐｇ／Ｌ，对照组则在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　上室内加入等量的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，分别在　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ下室内加入无血清化学条件培养基　进行孵育。孵育４８　ｈ后，分别收集各组培养液　上清和细胞蛋白进行相关检测。　检测方法：　硝酸还原一比色法检测一‘氧化氮：…氧化　氮化学性质活泼，生理条件下细胞内所产生的　一氧化氮，大多能很快反应生成亚硝酸盐。实　上海交通大学医　学院附属新华医　院，上海市儿科医　学研究所，上海市　２０００９２　何亚芳，女，１９８３　年生，江西省瑞昌　市人，汉族，上海　市儿科医学研究　所围产研究室，实　习研究员，主要从　事早产儿脑损伤　的发病机理与防　治研究。　１３１４＠　１６３．ｃｏｍ　通讯作者：陈惠　金，硕士，主任医　师，博士生导师，　上海市儿科医学　研究所围产研究　室，上海市　２０００９２　ｈｊｃｈｅｎｋ＠ｏｎｌｉｎｅ．　ｓｈ．ｃｎ　中图分类号：Ｒ３９４　２　文献标１只码：Ａ　文章编号：１６７３－８２２５　（２Ｏ’０｝４５－０８３９４－０５　牧稿日期：２０１０４）６－０８　修回日期：２０１０－０８－１６　（２０１００６０８００９／Ｄ・Ｑ）