蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测—酶抑制率法(分光光度法)

实验十三、蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测（GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测）方法一快速卡法一、目的要求：学习快速卡法测定有机磷农残快速检验法及熟悉检验结果评定。

二、实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。

三、实验试剂：1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片；2、pH 7.5 磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠[Na2HPO4•12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4]，用500 mL蒸馏水溶解。

四、实验步骤：1、整体测定法（1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g防入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上.(2) 取一片快速卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37 ℃恒温装置中放置10min。

预反应后的药片表面必须保持湿润。

（3）将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照。

2、表面测定法（粗筛法）（1）擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴缓冲液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。

（2）取一速片测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。

（3）放置10 min以上进行预反应，有条件时在37 ℃恒温装置中放置10 min。

预反应10 min，预反应后的药片表面必须保持湿润。

（4）将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照。

五、检测结果判断：1、结果判断结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制（为阳性）、未抑制（阴性）表示。

蔬菜农药残留快速检测基础知识一、蔬菜农药残留酶抑制法检测原理农残速测仪检测原理是酶抑制法，在必然条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，其抑制率与农药的浓度呈正相关。

在正常情况下，酶催化代谢产物水解，其水解产物与显色剂反映，产生黄色物质，用分光光度计在410纳米处测定吸光度随时间的转变值，计算出抑制率，通过抑制率的大小可以判断样品中是不是有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

二、农药残留速测法检测对象一、有机磷类农药包括：甲胺磷、水胺硫磷、乐果、敌百虫、敌敌畏、氧化乐果、马拉硫磷、甲基异柳磷、辛硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、乙酰甲胺磷、久效磷、杀螟硫磷、倍硫磷、毒死蜱等。

二、氨基甲酸酯类农药包括：叶蝉散、速灭威、西维因、涕灭威、克百威（呋喃丹）、异丙威、灭多威等。

三、农药残留速测法依据的标准中华人民共和国国家标准GB/—2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布四、检测方式一、准备阶段试剂或条件发生转变及时间距离比较长时，应重做。

①开机预热15分钟。

②仪器调0。

③仪器调100。

④制作对照。

第①、②、③步在天天利用前必需做，在改换新一瓶试剂时也必需做。

二、对照①在干净的试管顶用移液管加入提取液。

②用移液器提取的酶，加入到试管中。

③用移液器提取的显色剂，加入到试管中。

④适度晃动试管，使液体混合均匀，25℃左右的温度放置15分钟。

⑤15分钟后，用移液器提取的底物，加入到试管中，晃动试管，使液体混合均匀，马上倒入比色皿中，放入仪器1通道，按启动键开始检测。

⑥时间到后显示对照结果，一般对照值应在30以上，按Y保留，对照结束。

3、样品检测液①用天平称取表面干净蔬菜或水果1g剪成1cm左右的方块，放入小烧杯中。

②用移液器提取5ml的提取液用振荡器震荡2分钟。

③将烧杯中的液体用移液器提取的上清液到试管中，为检测液。

·50·试 验 研 究农业开发与装备 2013年第4期于人类健康。

因此，该“液肥”系列产品对环境、土壤和人类健康的影响，是无法用增产增收效果来衡量的。

3.3 操作简单、容易掌握该“液肥”系列产品应用操作简单，使用方便、针对性强，见效快，通过四年来的推广应用，深受广大农民群众欢迎，成为在发展绿色生态农业中起着不可忽视的作用。

3.4 增强植株抗性，达到健身栽培效果明显该“液肥”系列产品应用后，作物生长健壮，减轻了自然灾害，减少农药和化肥用量，保证农产品的无公害、绿色、安全生产，促进了干旱地区的农业生产向着高产、高效、优质、绿色农产品方向发展的转变，促进了社会健康和文明发展，实现了农业的可持续发展。

摘要：介绍了采用酶抑制率法快速测定有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的技术，酶抑制率法即分光光度法，是根据在一定条件下，有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关，进而通过抑制率来判断蔬菜中是否含有有机磷及氨基甲酸酯类农药的存在。

因其快速、简便、经济等特点，应用范围涵盖较广，保证有问题的蔬菜及时的排除。

关键词：酶抑制率法；快速检测；蔬菜；有机磷及氨基甲酸酯类；农药残留量；乙酰胆碱酯酶；分光光度法食品安全是民生工程，关系国计民生的头等大事。

农产品安全是食品安全工作中的重中之重，也是未来社会的发展趋势。

农产品质量安全是人民群众生存的基本要求，因此，农产品质量安全有保障，人民群众的身体健康和生命安全才有保障。

目前，各级政府和各级农业行政主管部门对蔬菜生产与流通环节中的监管措施和频次在不断强化。

这就需要我们开发出用时少、成本低，易操作的快速检测方法应用于蔬菜生产基地、蔬菜批发市场等地。

而传统的检测技术使用大型仪器设备，由于其检测时间长、成本高、对检测人员专业性要求高等不利因素而无法马上对有问题的农产品进行应急处理。

1 实验原理酶抑制率法是在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，根据这一昆虫毒理学原理，用在对农药残留的快速检测中。

蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测
随着工业的发展和农业的现代化，化学农药的广泛应用成为农业生产中的常见现象。

因此，农产品中农药残留已成为一个普遍的问题。

为了确保消费者的健康和安全，需要对
农产品中的农药残留进行检测。

其中，有机磷类及氨基甲酸酯类农药是最常见的农药残留
物之一。

本文将介绍如何快速检测蔬菜中的有机磷类及氨基甲酸酯类农药残留量。

有机磷类农药是一类广泛使用的农药，它的主要成分是磷酸酯化合物。

这种农药可以
杀死害虫、杂草和真菌，从而保护作物的生长。

但是，它往往会对环境和人体产生有害影响，因此需要对其进行检测。

在蔬菜中，有机磷类农药的常见成分包括马拉硫磷、甲胺磷、乐果等。

针对这些残留物的检测方法主要有色谱法、荧光法和电化学法等。

其中，色谱法
是最常见的检测方法之一。

该方法可以快速和准确地检测出有机磷类农药在蔬菜中的残留量。

除了现有的检测方法之外，近年来还出现了一种新型的检测技术——基于光纤传感器
的检测技术。

这种技术利用光纤的传导性能和敏感度来检测蔬菜中的农药残留。

与传统的
检测方法相比，基于光纤传感器的检测技术具有响应快、准确、灵敏度高等特点，可以快
速地检测出蔬菜中的农药残留，同时可节省检测成本和时间。

总之，在蔬菜中确定有机磷类及氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测对保障农产品质
量和消费者的健康至关重要。

通过创新技术和不断的研究，我们可以期望未来的检测方法
会更加成熟、高效和安全。

蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法标准蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法标准1. 范围本标准规定了由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法。

本标准适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。

测试方法酶抑制率法2. 原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。

正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在410nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

3.试剂3.1 pH8.0缓冲溶液：分别取43.5g无水磷酸氢二钾与2.2g磷酸二氢钾，用510mL蒸馏水溶解。

3.2 显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg 碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4°C冰箱中保存。

3.3 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.1mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。

保存期不超过十天。

3.4 乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3 min 的吸光度变化D A0值应控制在0. 3以上。

摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超十天。

3.5 可选用由以上试剂制备的试剂盒。

乙酰胆碱酯酶的ΔA0值应控制在0.3以上。

4 仪器4.1 分光光度计或相应测定仪。

4.2常量天平。

4.3 恒温水浴或恒温箱5 分析步骤5.1 样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL 缓冲溶液，静制十五分钟，之间需振荡几次，待用。

5.2 对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，依次加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂、0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值ΔA0。

关于农残快速检测中假阳性问题及对所谓“对比数据库”的说明一、酶抑制率法检测原理我们生产的LDSJ-RM10型10通道农药残留速测仪,是采用国家标准GB/T 5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》规定的分析方法。

该方法采用酶抑制率法(分光光度法),分析原理是基于一种生物化学反应,即:在正常情况下乙酰胆碱(底物)在乙酰胆碱酯酶的作用下发生水解反应,生成胆碱和乙酸,生成的胆碱与二硫双对硝基苯甲酸(显色剂)产生显色反应,使反应液呈黄色。

如果样品中带有有机磷和氨基甲酸酯类农药,由于农药的存在能抑制酶的活性,使上述生物化学反应速度减慢,从而使水解反应生成的胆碱减少,使显色反应产生的黄色变浅。

通过测量一段反应时间内(国家标准规定为3min)溶液颜色的变化率(吸光度随时间的变化值),即表示为农药抑制酶活性的抑制率。

通过测量抑制率的大小,可以判断出样品中是否有高剂量农药的存在。

二、酶抑制率法产生假阳性问题的原因酶抑制率法测定某些蔬菜中农药残留量存在假阳性,这一点在国家标准GB/T 5009.199-2003的说明中就明确指出:“15.1葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中,含有对酶有影响的植物次生物质,容易产生假阳性”。

综合文献资料和我们的研究,产生假阳性的原因如下:1.某些蔬菜样品中含有对酶有抑制作用的植物次生物质,它同样也能起到农药抑制酶活性的作用,故会使测定结果偏高,即产生假阳性,严重时使酶完全失去活性,导致无法测量(如蒜)。

2.另一类蔬菜色素含量高(如韭菜含叶绿素高),汁液多(如番茄等),经样品处理后会使测试溶液带色或发浑,而这些带色或发浑的溶液在测试时容易发生变化,从而影响光度法的测定。

三、关于“农药残留果蔬对比数据库”是否科学有效的问题所谓的“对比数据库”实际上是2004年上海某研究所和上海某公司共同研究出来的一个对付假阳性的数据库参照对比软件。

蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测（KJ201710）1范围本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测方法。

本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速测定。

酶抑制（率）法（分光光度法）2原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。

正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。

3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

3.1 试剂3.1.1丙酮（CH3COCH3）。

3.1.2磷酸氢二钾（K2HPO4）。

3.1.3磷酸二氢钾（KH2PO4）。

3.1.45,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）。

3.1.5碳酸氢钠（NaHCO3）。

3.1.6碘化乙酰硫代胆碱（ C7H16INOS）。

3.1.7pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水中，混匀。

3.1.8显色剂：分别取160 mg 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。

3.1.9底物：取125 mg碘化乙酰硫代胆碱，加15 mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4 ℃冰箱中保存备用。

保存期不超过两周。

3.1.10乙酰胆碱酯酶：4 ℃冰箱中保存备用。

3.2 参考物质—1—3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥98%。

表1 有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量3.3 标准溶液的配制3.3.1克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液（1000 μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。

关于农残快速检测中假阳性问题及对所谓“对比数据库”的说明一、酶抑制率法检测原理我们生产的LDSJ-RM10型10通道农药残留速测仪，是采用国家标准GB/T 5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》规定的分析方法。

该方法采用酶抑制率法（分光光度法），分析原理是基于一种生物化学反应，即：在正常情况下乙酰胆碱（底物）在乙酰胆碱酯酶的作用下发生水解反应，生成胆碱和乙酸，生成的胆碱与二硫双对硝基苯甲酸（显色剂）产生显色反应，使反应液呈黄色。

如果样品中带有有机磷和氨基甲酸酯类农药，由于农药的存在能抑制酶的活性，使上述生物化学反应速度减慢，从而使水解反应生成的胆碱减少，使显色反应产生的黄色变浅。

通过测量一段反应时间内（国家标准规定为3min）溶液颜色的变化率（吸光度随时间的变化值），即表示为农药抑制酶活性的抑制率。

通过测量抑制率的大小，可以判断出样品中是否有高剂量农药的存在。

二、酶抑制率法产生假阳性问题的原因酶抑制率法测定某些蔬菜中农药残留量存在假阳性，这一点在国家标准GB/T 5009.199-2003的说明中就明确指出：“15.1葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性”。

综合文献资料和我们的研究，产生假阳性的原因如下：1．某些蔬菜样品中含有对酶有抑制作用的植物次生物质，它同样也能起到农药抑制酶活性的作用，故会使测定结果偏高，即产生假阳性，严重时使酶完全失去活性，导致无法测量（如蒜）。

2．另一类蔬菜色素含量高（如韭菜含叶绿素高），汁液多（如番茄等），经样品处理后会使测试溶液带色或发浑，而这些带色或发浑的溶液在测试时容易发生变化，从而影响光度法的测定。

三、关于“农药残留果蔬对比数据库”是否科学有效的问题所谓的“对比数据库”实际上是2004年上海某研究所和上海某公司共同研究出来的一个对付假阳性的数据库参照对比软件。

主题：绿色食品—果蔬农残检测操作规范受控：受控主编：杨翠欣编号：XYWJ/Q-C008（2）审核：熊颖版本： 1归口：质量页次：抄送： 园区运营 园区管理 市场修订次数：第1次修改人力资源 IT 项目 财务旅游 种植 养殖生效日期：2018.08.011/5绿色食品—果蔬农残检测操作规范1.酶抑制率法（分光光度法）1.1测前取样1.1.1绿色食品果蔬采收前都需进行农药残留检测。

1.1.2采样方法及取样量见《绿色食品—果蔬农残检测取样操作规范》。

1.2.溶液的配置1.2.1缓冲液：将缓冲液试剂倒入烧杯中，加蒸馏水500ml,溶解，混匀后倒入瓶中即可。

1.2.2显色剂：在标有显色剂的瓶中添加5ml缓冲液，摇匀。

在冰箱中冷藏（1~4°c）切勿冷冻结冰。

1.2.3底物：在标有底物的瓶中添加5ml蒸馏水，摇匀。

在冰箱中冷藏（1~4°c）切勿冷冻结冰。

1.2.4酶：将酶液倒入酶试剂专用瓶中。

在冰箱中冷藏（1~4°c）切勿冷冻结冰。

1.3仪器使用1.3.1将仪器打开，仪器要求开机后预热3分钟以上，才能稳定使用，为了保证测试效果的准确性，从开机到检测间隔时间要大于3分钟。

1.3.2通道开关初次使用默认为全部通道是打开的状态，由符号√表修订次数：第1次修改页次：2/5示。

通过上下移动光标，并按“确定”键，实现通道打开和关闭两种状态的切换。

通道关闭由“×”表示。

1.4 操作方法1.4 .1对照液测定在离心管中，用移液枪依次加入50uL酶，3ml缓冲液、20uL显色剂摇匀，放到37度的水中静置10分钟。

用移液枪加入20uL底物。

摇匀后移到比色皿中，放入仪器检测。

点击“对照”三分钟后检测完成。

当酶活性不足时，仪器将给出提示。

1.4.2样品检测擦去绿色食品果蔬样品表面泥土，称取2克果皮（叶菜剪成1cm左右的菜样，块根菜取横截面）放入烧杯中，加入8ml缓冲液，摇匀，静置2分钟，获取样品液。