免疫学实验：流式CBA多因子检测详解

CBA细胞因子说明书552364
细胞因子是细胞经刺激而合成分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。

细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长和分化，调控免疫应答，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和杀伤肿瘤细胞效应，促进或抑制其他细胞因子的合成，促进炎症过程，影响细胞代谢等。

因为细胞因子和机体的生命活动息息相关，故科学家们经常检测体内或体外的可溶性细胞因子及受体。

检测细胞因子最常用的方法是ELISA方法，这种方法也是非常适合单个因子检测的。

但在监测某个疾病进程中，需要在不同的时间点检测小体积样本的多个细胞因子时，流式细胞术的多参数优势就非常适用。

尤其在临床科研方面，经常会遇到小体积的珍贵临床样本，如儿科样本。

BD的CBA （Cytometric bead array）是用流式方法检测多种可溶性细胞因子，引入了荧光标记的beads作为载体，抗体包被在beads上，检测抗体标记另一个荧光信号。

通过双抗体夹心法检测可溶性抗原。

最多可同时检测30个细胞因子，需要的样本体积仅25-50ul。

多个细胞因子同时检测不仅节省了样本，提高了效率，更重要的提高了实验的精准度。

10000
1000
MFI
100
10
1
1
10
100 1000 10000
pg/mL
曲线自动生成 线性或对数形式显示 IL-4 回归曲线拟合
IFNg IL-2 TNFa IL-6 IL-8
样本检测举例
Human Th1/Th2 Standard: Blank
Human Th1/Th2 Standard: 14 pg/ml
流式高通量多因子检测技术及应用
细胞因子与疾病

免疫调节作用：
➢ 调节着每个细胞乃至组织活动；
➢ 直接参与了细胞间相互作用以及细胞 外微环境的变化
参与疾病发生：
类风湿性关节炎； 强直性脊柱炎 SLE； 银屑病； 细胞因子风暴
以Th淋巴细胞为枢纽的细胞因子调节网
细胞因子与疾病治疗
多因子检测技术
流式多重定量技术
1 2 3
1 2 3
4
6
微球
PE 荧光强度 即为靶蛋白量 5 4
FL4 (Differentiator Parameter)
不同大小种类微球分布
FL2 (Reporter Parameter)
AimPlex检测过程
60分钟的抗原 抗体孵育
30分钟生物素 化检测抗体孵
育
20分钟链霉素 亲和素-PE孵育
IL-17A
400
y = 0.8712x + 13.712
300
R²= 0.9391
200
100
0 0 100 200 300 400
什么是AimPlex多因子检测技术？
AimPlex多因子检测技术： 利用不同尺寸、不同荧光强度的多个 微球群实现多因子的检测 利用该技术，配合任何一台配备 488nm激发光的流式细胞仪，即可实现 24个指标的同步检测。

Cytometric Beads Array (CBA)系统一、简介1、CBACBA是有一系列荧光强度不同的微球，用于可溶微粒的流式检测。

每个CBA微球在FL3有特定的荧光强度，大小一致，包被有适用于特定分析（如其他抗体或可溶性蛋白）的特异性抗体，提供了类似ELISAs孔板的捕获表面。

简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测。

这种技术可大大节约样本用量，避免ELISAs分析时对样本过度稀释导致分析灵敏度的降低。

CBA灵敏度高，重复性好，操作简便，可以同时进行多种流式分析，与传统的ELISAs 检测相比，CBA具有强大的优势：●能够同时对单个样本进行多种检测。

●较传统检测节省样本量9倍。

●与ELISAs相比灵敏度高、重复性好。

●所有分析只需一组标准曲线。

●避免酶联反应所致人工假象。

●节省操作时间。

●节省检测时间。

2、CBA原理●检测物与捕获微球共孵育。

●洗涤。

●标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）。

●洗涤。

●流式细胞仪检测。

●CBA分析软件批量数据分析。

3、CBA分析软件CBA系统除了CBA微球外，还包括相应的仪器设置系统、标准品、缓冲液、检测系统及软件。

CBA分析软件类似苹果机的EXCEL分析，它具有多种预设参数，适用于各种稀释度的标准值测定，能够自动计算生成4参数标准曲线（logistic或log log）。

二、CBA 产品1. Mouse Immunoglobulin Isotyping CBA （Cat.No.04200K ）此试剂盒（100 test ）一次检测可以得到相当于9孔ELISA 检测的结果。

适用于腹水或培养组织上清中小鼠新克隆的单抗重链轻链型别的鉴定。

2. Human Th1/Th2 Cytokine CBA （6 Cytokine ，50 test ）（Cat.No.550749）此试剂盒（50 test ）一次检测可以得到相当于6孔ELISA 检测的结果。

➢每管分1mL细胞； ➢4℃，400g离心5min； ➢弃尽上清，每管加50μL Fc block彻底悬浮，4℃孵育
15min； ➢每管加10μL对应的抗体稀释液，4℃避光孵育30min（铝
箔包好）； ➢每管加500μL PBS，4℃，400g离心5min； ➢弃尽上清，每管加500μL PBS悬浮细胞，尼龙膜过滤后流
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
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