外标两点法

外标两点法对数方程是在应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELS D）进行药物分析时的含量计算方法。

大家都知道在用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）的定量用外标两点法对数方程，并且药典也要求如此！比如银杏叶、知母、黄芪、人参、署预、（中药含有皂苷的），化药也有一些。

但对数方程的列法却各不相同，有很多人是3楼的列法：峰面积和进样量同时去对数。

但就药典的文字理解：“对数方程”是指在方程里有一个对数，而同时取对数列出来的方程叫双对数方程。

根据最小二乘法应该是进样量(ug)与峰面积的对数的线性方程。

我们用蒸发光散射检测器时，由于散射光的信号为非线性的，根据ELSd的工作原理，进样质量和ELSD检测响应值（峰面积）一般不呈现良好的线性。

因为信号相应值与物质质量的对数呈线性关系，如果对进样质量和峰面积分别取常用对数后，两者呈现良好的线性关系，但是它是一条不经过原点的直线，所以在含量测定时必须使用外标两点法，通常称作外标两点法对数方程，在中国药典20 00版2002增补本以及2005版、2010版中，凡采用HPLC-ELSD方法进行含量测定时，均有“采用外标两点法对数方程计算含量”一句。

进两个不同浓度的对照品, 将进样量和对应的峰面积取对数后，由两点确定方程，方法是将两组数值代入直线方程：y=Kx+b，即可求出式中的K和b。

再将求出的K和b代入公式：InA=KInC+b ，即可求出对数方程。

公式为：InA=KInC+b
A：峰面积
K：为公式y=Kx+b中的K
C：进样量
b：为公式y=Kx+b中的b
计算时将样品峰面积（A）代入方程InA=KInC+b，计算出InC后，再取反对数就可以计算出C了．再电子表格计算较为方便．
在Excel中进行直线回归，可得出该方程，最后求出带入计算，就OK了！
解析外标两点对数方程计算黄芪药材含量
方法：照高效液相色谱法，ODS柱，以乙腈-水（32：68）为流动相，流速1ml/min，经蒸发光检测器检测，用外标两点对数方程计算黄芪药材中黄芪甲苷的含量。

仪器：安捷伦1100型液相色谱仪、蒸发光检测器（ELSD）、ODS柱（4.6um*5mm*200mm）供试品：黄芪药材（检测成分：黄芪甲苷）
关键词：高效液相法、蒸发光检测器、黄芪甲苷、粉碎、提取物、外标两点对数方程
正文：
前处理：
取约20g的黄芪药材放置于小型粉碎机内，粉碎后，盛装在密闭的容器中待用。

供试品制备：
取黄芪药材粉末两份，Ⅰ.4.0037g；Ⅱ.4.0022g。

分别置索氏提取器中，加甲醇40ml，浸泡过夜（大于8小时）。

第二天，加甲醇适量，加热回流4小时，提取液浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇（制法：把水加入正丁醇中至饱和）振摇提取4次，每次
40ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷；通过D101型大孔吸附树脂柱(备注：自己装填)，并以水50ml 洗脱，弃去水液；再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液；继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干；用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

简单讲，即把黄芪药材最后提取物（黄芪甲苷）溶解到5ml甲醇中。

对照品制备：
称取黄芪甲苷对照品（中检所购入）0.0512g至100ml容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。

测定：
系统平衡后，精密吸取对照品溶液10ul进样，得色谱峰面积Ⅰ.259457 ；进样20ul，得色谱峰面积Ⅱ.523039。

供试品溶液进样20ul，两针，色谱峰面积为：
Ⅰ.909836，Ⅱ. 902925 。

根据对照品峰面积和进样量，以外标两点对数方程计算供试品含量。

两点对数方程定义：
是利用两点的对数值呈线性关系求解二元一次方程y=ax+b。

本题是利用对照品溶液两针进样量的对数值和所得峰面积的对数值呈线性的关系，把两组数据带入方程y=ax+b中，求得a和b，即求解了该方程式。

然后带入供试品峰面积的对数值，求得供试品进样量的对数值，对其求反对数得供试品进样量（黄芪甲苷的量）。

方程中x、y 值均为进样量和峰面积取对数（lg）后的数值。

简单讲，就是通过对照品溶液两针的进样量和峰面积（均取对数lg）求解方程式后，把供试品峰面积（取对数lg）带入方程式求得供试品的进样量。

数据处理：
根据外标两点对数方程，应先计算得到方程式中的x、y值，才能求解此方程式。

即取对照
品进样量的对数值为x，取对照品峰面积对数值为y，计算结果如下：
---------对照品-----------Ⅰ--------------------------Ⅱ
---------进样量：---0.0512g×10ul（5.12ug）-----0.0512g×20ul（10.24ug）
进样量取lg，得x：--------0.7093 --------------------1.0103
-----色谱峰面积：--------259457---------------------523039
峰面积取lg，得y：--------5.4141---------------------5.7185
方程式求解：
根据“数据处理”中求得的x、y值，通过Excel图表中的XY散点图，以（0.7093，5.4141）、(1.0103, 5.7185)两点，求得方程如下：
供试品进样量求解：
取供试品色谱峰面积的对数值，得y，带入已求得的方程式y=1.0112x+4.6969，求得x，如下：
---------供试品------------Ⅰ----------------------Ⅱ
---------称样量：--------4.0037g -----------------4.0022g
-----色谱峰面积：--------909836-------------------902925
峰面积取lg，得y：--------5.9590-------------------5.9557
通过方程，求得x：--------1.2481-------------------1.2448
根据lg(进样量)=x，求x（1.2481、1.2448）的反对数，得供试品进样量:Ⅰ.17.7052ug 、Ⅱ.17.5711ug（黄芪甲苷）
含量计算：
根据供试品称样量、样品的稀释倍数5ml及20ul进样量中黄芪甲苷的量，求得：
供试品Ⅰ含量：（17.7052ug×5ml/4.0037g/20ul）×100%=0.1106%
供试品Ⅱ含量：（17.5711ug×5ml/4.0022g/20ul）×100%=0.1098%
平均值为：（0.1106%+0.1098%）/ 2 = 0.11%
结果：
该批黄芪药材中含黄芪甲苷的量为0.11%。

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