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外标两点法对数方程是在应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）进行药物分析时的含量计算方法。
我们用蒸发光散射检测器时，由于散射光的信号为非线性的，根据ELSD的工作原理，进样质量（ug）和ELSD检测响应值（峰面积A）一般不呈现良好的线性。
因为信号相应值与物质质量的对数呈线性关系，如果对进样质量和峰面积分别取常用对数后，两者呈现良好的线性关系，但是它是一条不经过原点的直线，所以在含量测定时必须使用外标两点法，通常称作外标两点法对数方程。
进两个不同量的对照品（ul）, 将进样质量（ug）和对应的峰面积（A）取对数后，由两点确定方程，方法是将两组数值代入对数方程：lgA=KlgC+b，即可求出式中的K和b。
公式为：lgA=KlgC+b，
A：峰面积
K：为公式中参量
C：进样质量（ug）
b：为公式中参量
计算时将样品峰面积（A）代入方程lgA=KlgC+b，计算出IgC后，再取反对数就可以计算出C了。
HPLC—ELSD法测定桔梗中桔梗皂苷D的含量植物资源与环境2001,10(4):11—13JoMofP/antResourcesandEr~vlronmentHPLC—ELSD法测定桔梗中桔梗皂苷D的含量朱丹妮,舒娈,郅慧,高山林(中国药科大学,江苏南京210038)摘要:首次采用高效液相一蒸发光散射检测器色谱法测定桔梗[P/atycodonl朋卿1帅(Jacq.)A.Dcj中桔梗皂苷D吉量,c.a(5.um,46哪×250哪)为色谱拄,(乙腈):"水)=28:72为流动相,流速O7mI3min,ELSD-5~为检测器,外标法定量.结果表明:桔梗皂营D在O.3～2.4腭范厨内呈线性,回收率为99.57%(n=5),RSD为110%.对8种不同来源的桔梗材料和加个四倍体株系桔梗皂甙D含量的测定说明,此法是测定桔梗皂苷D的较佳方法,可作为我国桔梗质量控制和评价的一种可靠的技术.关键词:桔梗;桔梗皂甙D;高效液相一蒸发光散射中国分类号:$657.72;S:~i7.239;o946.83文献标识码:A文章编号:l0(2∞1)04-001I-03I)e~fionofpla留0曲D.m用哟m峨肋nⅢby珈PIⅡI地山0dZttUDan-ni,sHuh锄,丑ⅡHui,GAOshan—bn(ChinaPharmaceuticalUniversity,Naniing210o38,cna),J.P/o~aRe∞Ⅳ.&Er~ron.2cl01.10(4):11—13A晌ct:1kSp4perestabliBhedanHPLc-E|Dmeth0dtodeterminethe~,nlentofplatye0dinDin differentsampofPlacycodon曲%Ⅲ(Jaeq.)A.Dc.Allt~hC18Ilr|lrI(5,4.6mmX250mm) w鹊used,mobilepIIasew鹊(aeetonimle):(water)=28:72at0.7m[/n~,l即eed.Ⅱs】)-500deteemrwasUSedforqualitativeandqu~ltitativeanalysisinextemalstandardⅡIetll0d.Obrainedresultsindie~tedthatwithin0.3— 2.4pl0ayeodinDhadago0dlinearity.1heaveragerecoveryw舾99.57%(n=5)wi由RSD1.10%.Inordertoevaluatetllereliabilltyoftllisnewmethod.thecontentofplatye~linDin8eV elldifferent疵lals~np]esand20inducedtetraploidlinesintissuecultureweredetermined.11leobtainedres ultsindie~tedthatthisiSfirsttimetoreportanadvancedandeffectivem柚0dfortlleqltv~ntm]andevaluatiOnforrawmaterialsofP..Key删rds:Placycodo~姗回z叭m(J.)A.IX1.;p【a|yo0djnD;l~yploid;}删一ELsD 中药桔梗为桔梗科植物桔梗(im耐‰m(Jacq.)A.IX:.]的干燥根.在我国药用历史悠久,有宣肺,利咽,祛痰和排脓之教….桔梗皂苷为桔梗中主要有效成分,桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷.中国药典中对桔梗总皂苷含量的测定用重量法…,无桔梗皂苷D含量测定方法的记录.韩国学者采用反相ttPLC测定桔梗皂苷D.测得韩国国内桔梗根中的皂苷D含量为0.050%～0.090%."l.日本学者用ttPLC法以'INK-GEL酰胺.8o为分析柱,以(乙腈):V(水):82:18为洗脱液,检测波长203nm,定量或定性分析桔梗皂苷D;我国学者许传莲等采用I/P-IfPLC法测定不同产地桔梗中皂苷D的含量,选择C,.柱为色谱分析柱,检测波长为210nm.由于桔梗皂苷D无C=C双键和共轭结构,无强的发色基团,末端吸收(203n/in,210nm)检测干扰较大.作者首次采用ttPLC.E1SD法测定桔梗皂苷D含量,旨在为控制桔梗药材质量提供科学的分析方法.l材料和方法1.1材料来源供试的桔梗药材购白安徽省毫州药材公司.经余伯阳教授鉴定;桔梗四倍体株系由中国药科大学遗传育种教研室经组织培养人工诱导培育;对照品桔梗皂苷D由吉林农业大学刘墨祥教授惠赠.1.2仪器与试剂Shin~lzu10A高效液相色谱仪(配备Shama~C—R6A数据处理机,NlteehELSD.500型蒸发光散射收藕日期:20Ol-O7—23作者简介:朱丹妮(1946一).女,上海市人.学士.副研究员,长期从事中药复方化学和物质基础研究.2植物资源与环境第1O卷检测器)乙腈(色谱纯1,水为二次重蒸水.1.3色谱条件色谱柱为c8柱(5,4.6mm×250ram):流动相:(乙腈):V(水)=28:72;流速0.7mLhnin;柱温为室温;进样量:2(】;ELSD检测器检测参数:漂移管温度l11;载气()流速2.75Um_ml_理论塔板数据按桔梗皂苷D峰计算,应不低于30C0.1.4供试品提取方法比较1.4.1回流提取精密称取干燥粉碎过5O日筛的桔梗药材200mg,加入5OrIlL甲醇于索氏提取器中四流提取4h,过滤,滤液回收至干,残渣加入25mL水溶解,以乙醚萃取3次.水液以水饱和正丁醇萃取5次,合并正丁醇液,LHj收至干,残渣以甲醇溶解并定容5mL作为供试品.1.42超声提取精密称取干燥粉碎过5O目筛的桔梗药材2OOmg,加入25mL甲醇超声提取30min, 过滤,滤渣再加入25mL甲醇超声提取30mln,过滤,用少量甲醇洗涤滤渣,合并2次滤液,回收甲醇至于,将残渣以甲醇溶解并定容于5mL容量瓶中. 以上2种供试液按上述色谱条件注入液相色谱仪,测定峰面积,试验表明两种方法制备的供试品中桔梗皂苷D的含量无显着性差异,因此以下供试品溶液的制备采用操作简便的超声提取法.l_5对照品溶液的制备精密称取桔梗皂苷D对照品1.2mg,置10mL容量瓶中加适量甲醇溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液(O.12rrrIlL).l_6测定方法按超声提取法制备供试品溶液精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20uL,注入液相色谱仪,按以上色谱条件测定峰面积,峰面积及浓度均取自然对数后用标准曲线计算桔梗皂苷D含量.1.7不同产地及桔梗多倍体样品桔梗皂苷D含■测定取河南,广西,安徽,山西,湖南,湖北和江苏产桔梗药材及2o个四倍体株系试管苗,依上法测定桔梗皂苷D含量2实验结果2.1桔梗皂苷D浓度和峰面积线性关系的考察分别取上述对照品溶液2.5,5,lO,l5和2ouL进样,按上述色谱条件测定峰面积,以色谱峰峰面积的自然对数为纵坐标,以桔梗皂苷D对照品进样量的自然对数为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程:l,=1.7858X+4.8797,r=0.9991,线性范围为0.3～2.4tzg表明线性关系良好2.2精密度试验精密吸取桔梗皂苷D对照品溶液2OuL,重复进样5次,测定其峰面积积分值分别为44191, 44980,44O69,44784和43806,平均44366,RSD为1.12%(n=5),表明进样精密度良好2.3稳定性试验将同一供试品溶液分别在0,2,4,6和8h进样.测得桔梗皂苷D的峰面积分别为24384,24775, 248o3,24773和24468,均值24641,ItSD为0.81%,表明样品溶液在8h内稳定2.4重现性试验取同一产地桔梗药材5份,按1.4.2项下制得供试品,按以上色谱条件测得桔梗皂苷D的含量分别为0.2470%,02442%,0.2475%,0.2427%和0.2447%,平均0.2452%,RSD=0.82%,表明用此方法测定桔梗皂苷D重现性较好.2.5回收率试验采取加样回收测定方法,精密称取已知含量同批药材粉末(其中含桔梗皂苷D0245%)5份,每份约100mg,加入对照品溶液2mL(含桔梗皂苷D 0.24mg),按1.4.2项下制备,进样2o止,测定桔梗皂苷D峰面积,计算回收率,结果见表l.可以看出5份样品的平均回收率为99.57%,表明此法的回收率较高.2.6不同产地桔梗药材中桔梗皂苷D含■采自河南,广西,安徽,山西,湖南,湖北和江苏的桔梗药材中桔梗皂苷D的含量(ng)分别为2.65,2.68,2.49,2_86,2.8o,2.68和2.78,变动于2.49Ⅱg～2.86mug(0.249%～0.286%)之间,但均显着高于采用反相HPLC法测得的韩国产桔梗根中的桔梗皂苷D含量(O050%～0.090%)3J.2.7桔梗多倍体样品桔梗皂苷D含■根据本研究建立的方法,以桔梗二倍体为对照测定了20个多倍体株系(称样量均为200mg)桔梗皂苷D含量,结果见表2.第4期朱丹妮等:HPLC—ELSD法测定桔梗中桔梗皂苷D的含量13 表1桔梗皂苷D加样回收覃试验结果Table1R咧惦0f呻叫哪r0fp咖_mD襄2桔梗四倍体株系殛亲奉二倍体试管苗桔梗皂苷Ⅱ音量2Tk蛳t0f曲哪∞d-ⅢD-mtet瑚p10柚删曲,l.id0f∞出嘞mⅢIJ日蚺.)A.Dc.表2表明:20个四倍体株系的桔梗皂苷D含量在2.02~ng/g～306IIg之问,有8个株系高于=:倍体,c.5株系含量最高达3.06lg,比二倍体高176%,余均与二倍体接近,桔梗四倍体,二倍体株系测得的桔梗皂苷D含量大多在2.5mg(0.25%)以上,与7省区采集的桔梗根的桔梗皂苷D含量相近四倍体的田问农艺性状及根部产量优于二倍体,因此为进一步选育产量高及皂甙含量高的优良桔梗品种展示了较好的前景3讨论蒸发光散射检测器ELSD是一种通用质量型检测器,流动相由热气流使之气化喷雾.再进人加热管,溶剂在此挥发,所得分析检测的物质颗粒通过狭窄光束散射,由光电倍增管收集,ELSD的响应取决于被分析物质颗粒的数量和大小,不受溶剂的干扰,已成功用于皂苷,生物碱,萜类内酯,氨基酸和糖类等分析,是分析无紫外吸收和紫外吸收弱成分的有力工具本实验的条件是经过反复实验后,综台评价而得出的.作者首次采用HPLC—ELSD法测定桔梗皂苷D的含量.并通过对7个不同来源的桔梗材料和20个四倍体株系桔梗皂苷D的含量测定,验证此方法用于桔梗皂苷D含量测定是可行的.供试样品溶液的制备采用2种方法.一种为超声提取法;另一种为传统提取法经过测定,得出两种方法制备的供试品中桔梗皂苷D的含量无显着性差异.因此选择采用步骤少,操作简便的超声提取法作为供试品的制备方法.2OOO年版中华人民共和国药典未收载桔梗皂苷D的含量测定方法,仅用重量法测定正丁醇部位的量,比较粗糙,HPLC—ELSD法的建立,为控制桔梗的质量和试管苗的早期筛选提供了新的方法.参考文献:[1]中华^民共和国药典委员会.中华^民共和国药典2∞0年版(一部)[M]北京:化学工业出版社.2∞02252]肖祟厚中药化学[川上海:上海科学技术出版社.1997,419—421.【3jKimTJ,LeeSjlsolati~anddetemfimai~ofplaty,zodlnD platyc,od~【J.~malSeiTedmol,1990.3(3):339～341.[4]小木曾弘尚桔梗皂苷的I-IPLC定量分析J].国外医学中医中药分册,1995.17(5):33[5]原田正敏繁用生药成分定量M],京:东京广JIJ书店,j989j20一j33[6]许传莲.杨睹虎,郁毅男,等应用RP.I-IPLC法测定不同产地中桔梗皂苷DJ].吉林农业大学.1999.21(4):35—38.7]舒娈.高山林.桔梗蛆鲤培养技术的研究[J]植物资掉与环境,2.00110(3):63—64(责任编辑:宗世贤)。
外标两点法对数方程是在应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELS D）进行药物分析时的含量计算方法。
大家都知道在用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）的定量用外标两点法对数方程，并且药典也要求如此！比如银杏叶、知母、黄芪、人参、署预、（中药含有皂苷的），化药也有一些。
但对数方程的列法却各不相同，有很多人是3楼的列法：峰面积和进样量同时去对数。
但就药典的文字理解：“对数方程”是指在方程里有一个对数，而同时取对数列出来的方程叫双对数方程。
根据最小二乘法应该是进样量(ug)与峰面积的对数的线性方程。
我们用蒸发光散射检测器时，由于散射光的信号为非线性的，根据ELSd的工作原理，进样质量和ELSD检测响应值（峰面积）一般不呈现良好的线性。
因为信号相应值与物质质量的对数呈线性关系，如果对进样质量和峰面积分别取常用对数后，两者呈现良好的线性关系，但是它是一条不经过原点的直线，所以在含量测定时必须使用外标两点法，通常称作外标两点法对数方程，在中国药典20 00版2002增补本以及2005版、2010版中，凡采用HPLC-ELSD方法进行含量测定时，均有“采用外标两点法对数方程计算含量”一句。
进两个不同浓度的对照品, 将进样量和对应的峰面积取对数后，由两点确定方程，方法是将两组数值代入直线方程：y=Kx+b，即可求出式中的K和b。
再将求出的K和b代入公式：InA=KInC+b ，即可求出对数方程。
公式为：InA=KInC+bA：峰面积K：为公式y=Kx+b中的KC：进样量b：为公式y=Kx+b中的b计算时将样品峰面积（A）代入方程InA=KInC+b，计算出InC后，再取反对数就可以计算出C了．再电子表格计算较为方便．在Excel中进行直线回归，可得出该方程，最后求出带入计算，就OK了！解析外标两点对数方程计算黄芪药材含量方法：照高效液相色谱法，ODS柱，以乙腈-水（32：68）为流动相，流速1ml/min，经蒸发光检测器检测，用外标两点对数方程计算黄芪药材中黄芪甲苷的含量。
外标两点法对数方程是在应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）进行药物分析时的含量计算方法。
大家都知道在用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）的定量用外标两点法对数方程，并且药典也要求如此！比如银杏叶、知母、黄芪、人参、署预、（中药含有皂苷的），化药也有一些。
但对数方程的列法却各不相同，有很多人是3楼的列法：峰面积和进样量同时去对数。
但就药典的文字理解：“对数方程”是指在方程里有一个对数，而同时取对数列出来的方程叫双对数方程。
根据最小二乘法应该是进样量(ug)与峰面积的对数的线性方程。
我们用蒸发光散射检测器时，由于散射光的信号为非线性的，根据ELSd的工作原理，进样质量和ELSD检测响应值（峰面积）一般不呈现良好的线性。
因为信号相应值与物质质量的对数呈线性关系，如果对进样质量和峰面积分别取常用对数后，两者呈现良好的线性关系，但是它是一条不经过原点的直线，所以在含量测定时必须使用外标两点法，通常称作外标两点法对数方程，在中国药典2000版2002增补本以及2005版、2010版中，凡采用HPLC-ELSD方法进行含量测定时，均有“采用外标两点法对数方程计算含量”一句。
进两个不同浓度的对照品, 将进样量和对应的峰面积取对数后，由两点确定方程，方法是将两组数值代入直线方程：y=Kx+b，即可求出式中的K和b。
再将求出的K和b代入公式：InA=KInC+b ，即可求出对数方程。
公式为：InA=KInC+bA：峰面积K：为公式y=Kx+b中的KC：进样量b：为公式y=Kx+b中的b计算时将样品峰面积（A）代入方程InA=KInC+b，计算出InC后，再取反对数就可以计算出C了．再电子表格计算较为方便．在Excel中进行直线回归，可得出该方程，最后求出带入计算，就OK了！。
HPLC-ELSD法测定复方桔梗止咳片中桔梗皂苷D的含量张秀丽;郑琰;崔岩【摘要】Objective To determine the compound Platycodon cough of platycodin D establish a method. Method Using the method of HPLC-ELSD, The column was KromasilC18(4.6 mm ×250 mm,5 μm), mobile phase acetonitrile water (28∶72), The lfow rate was 0.9 mL/min, the ELSD drift tube temperature of 70 ℃, and the gas lfow rate is 3.0 SLPM/ min.Results The linear range of Platycodin D was 0.1950~4.8750 μg(r=0.9996), The average recovery was 99.44%, RSD=1.2% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility ,and suitable for quality control of compound Platycodon cough.%目的：建立一方法来测定复方桔梗止咳片中的桔梗皂苷D。
方法采用HPLC-ELSD法，色谱柱为KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（28∶72），流速为0.9mL/min，ELSD漂移管温度为70℃，气体流速为3.0SLPM/min。
结果在0.513～10.26μg线性范围内桔梗皂苷D进样量与峰面积呈良好的线性关系良好（r=0.9996），平均回收率99.44%，RSD=1.2%（n=6）。
XXXXXXXXX有限公司成品质量标准及检验操作规程1 品名：1.1中文名：桔梗1.2 汉语拼音：Jiegeng2 代码：3 取样文件编号：4 检验方法文件编号：5 依据：《中国药典》（2020年版第一部）。
6 质量标准：7.净药材质量标准：8 检验操作规程：8.1 试药与试剂：甘油、硫酸、乙醇、水、三氯甲烷、无水硫酸钠、甲醇、桔梗对照药材、乙醚、乙腈、桔梗皂苷D对照品、正丁醇、氨水、硅胶。
8.2 仪器与用具：显微镜、水浴锅、烘箱、硅胶G薄层板、高效液相色谱仪、二氧化硫测定仪。
8.3 性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。
8.4 鉴别：8.4.1取本品，切片，用稀甘油装片，置显微镜下观察。
8.4.2取本品粉末1g，加7%硫酸乙醇-水（1:3）混合液20ml，加热回流3小时，放冷，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，加水洗涤2次，每次30ml，弃去洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
另取桔梗对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法（附录7）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醚（2:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
8.5 检查：8.5.1 水分：不得过11.0%（附录15第二法）。
8.5.2 总灰分：不得过5.0%（附录17）。
8.5.3二氧化硫残留量照二氧化硫残留量测定法（附录58）测定，不得过150mg/kg。
8.6 浸出物：照醇溶性浸出物测定法（附录19）项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，不得少于17.0％8.6 含量测定：照高效液相色谱法（附录8）测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，YMC-Pack ODS-A色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈-水（25：75）为流动相；蒸发光散射检测器检测；理论板数按桔梗皂苷D峰计算应不低于3000。
桔梗JiegengPLATYCODONIS RADIX本品为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.Dc.的干燥根。
春、秋二季采挖，洗净，除去须根，趁鲜剥去外皮或不去外皮，干燥。
【性状】本品呈圆柱形或略呈纺锤形，下部渐细，有的有分枝，略扭曲，长7～20cm，直径O.7～2cm。
表面白色或淡黄白色，不去外皮者表面黄棕色至灰棕色，具纵扭皱沟，并有横长的皮孔样斑痕及支根痕，上部有横纹。
有的顶端有较短的根茎或不明显，其上有数个半月形茎痕。
质脆，断面不平坦，形成层环棕色，皮部类白色，有裂隙，木部淡黄白色。
气微，味微甜后苦。
【鉴别】 (1)本品横切面：木栓细胞有时残存，不去外皮者有木栓层，细胞中含草酸钙小棱晶。
栓内层窄。
韧皮部乳管群散在，乳管壁略厚，内含微细颗粒状黄棕色物。
形成层成环。
木质部导管单个散在或数个相聚，呈放射状排列。
薄壁细胞含菊糖。
(2)取本品，切片，用稀甘油装片，置显微镜下观察，可见扇形或类圆形的菊糖结晶。
(3)取本品粉末1g，加7％硫酸乙醇-水(1：3)混合溶液20ml，加热回流3小时，放冷，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20m1，合并三氯甲烷液，加水洗涤2次，每次30ml，弃去洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
另取桔梗对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10,ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】水分不得过15.O％(ⅨH第一法)。
总灰分不得过6.O％(附录ⅨK)。
【浸出物】照醇溶性浸出物测定法(附录X A)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，不得少于17.O％。
【含量测定】照高效液相色谱法(附录Ⅵ B)测定。
